NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN

LUẬN ÁN NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN.Ung thư tuyến tiền liệt (UTTTL) được mô tả lần đầu tiên năm 1853. Năm 1890 nhờ thủ thật gây mê ra đời, bệnh lần đầu tiên được điều trị bằng cắt tinh hoàn, nhưng hiệu quả không cao. Rất nhiều các thành tựu khoa học đã được áp dụng vào điều trị UTTTL. Các kết quả nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả điều trị UTTTL rất phụ thuộc vào thời điểm phát hiện bệnh. Với những trường hợp ung thư (UT) còn ở giai đoạn khu trú trong tuyến tiền liệt (TTL), khoảng 70- 85% bệnh nhân sống đến 10 năm sau khi điều trị triệt để. Với các trường hợp u xâm lấn ngoài vỏ bao vi thể TTL, tỷ lệ sống sau 5 năm là 85% và sau 10 năm là 75%. Còn với những trường hợp khối u đã xâm lấn bao tuyến lan rộng, tỷ lệ sống sau 5 năm giảm xuống 70% và 10 năm là 40% [1],[2],[3]. Vì vậy yêu cầu chẩn đoán sớm ung thư nói chung hay UTTTL nói riêng là rất quan trọng.

Trước đây việc chẩn đoán UTTTL chủ yếu dựa vào các biểu hiện về lâm sàng như các rối loạn hay tắc nghẽn đường niệu; Siêu âm và nội soi đánh giá tình trạng, kích thước của tuyến tiền liệt; Phương pháp mô bệnh học tại các mẫu mô sinh thiết TTL. Tất cả các phương pháp chẩn đoán này chỉ xác định được bệnh khi khối u đã hình thành . Vì vậy, phát hiện bệnh thường là ở giai đoạn muộn.

NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN Hiện nay, công nghệ được áp dụng ngày càng nhiều trong các nghiên cứu xác định cơ chế các bệnh lý khối u. Các nghiên cứu đã chứng minh tế bào ác tính của TTL cũng như các tế bào ung thư nói chung được hình thành do sự tích lũy và phát triển thông qua một loạt các thay đổi về các yếu tố di truyền, các biến đổi nội bào, ngoại bào và yếu tố di truyền ngoài gen dẫn đến sự gia tăng bất thường của tế bào ác tính, sự tăng sinh mạch, lẩn tránh apoptosis, và di căn đến các cơ quan. Đồng thời các nghiên cứu cũng phát hiện một số các phân tử mới: chỉ xuất hiện trong các tế bào ung thư; một số các phân tử chỉ được sản xuất bởi các tế bào ung thư; và một số phân tử được cơ thể sản xuất ra như một phản ứng với khối ung thư. Tất cả các phân tử này được gọi là dấu ấn phân tử. Các dấu ấn phân tử có đặc điểm là cung cấp các thông tin về đặc tính sinh học của khối u và có thể được định tính bằng phương pháp mô bệnh học, hoặc có thể định lượng được bằng một số phương pháp sinh học phân tử trong huyết thanh hoặc các dịch sinh học. Việc xác định các dấu ấn này cho phép chẩn đoán sớm, đặc hiệu bệnh UTTTL.
Kháng nguyên (KN) sớm ung thư tuyến tiền liệt (EPCA-2) là một dấu ấn phân tử đã được công nhận là đặc hiệu cho UTTTL. Dấu ấn này có 3 vị trí kháng nguyên đã được biết rõ trình tự và có thể được phát hiện ở cả mô và các dịch sinh học của bệnh nhân UTTTL bằng kháng thể (KT) đặc hiệu. EPCA-2 còn được chứng minh là xuất hiện sớm 2 năm trước khi có các biểu hiện ở mô bệnh học, đồng thời sử dụng KT xác định EPCA-2 trong máu cho phép chẩn đoán UTTTL với độ nhậy là 92% độ đặc hiệu là 94% [4],[5],[6].
Sử dụng kháng thểđặc hiệu để phát hiện các dấu ấn ung thư tại mô và các dịch sinh học có giá trị sớm trong các phương pháp chẩn đoán. Đồng thời, nhiều nghiên cứu còn sử dụng kháng thể như một chất dẫn đường cho các thuốc chống ung thư đến đúng các tế bào ung thư cần tiêu diệt, hạn chế tác dụng không mong muốn trên tế bào lành. Ứng dụng kháng thể trong chẩn đoán và điều trị là những lĩnh vực đang ngày càng được phát triển hoàn thiện để có thể ứng dụng rộng rãi.
Đề tài nghiên cứu này được thực hiện với 2 mục tiêu:
1. Tạo kháng thể đặc hiệu kháng nguyên tái tổ hợp EPCA-2.
2. Đánh giá khả năng ứng dụng kháng thể đặc hiệu kháng EPCA-2 trong chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt.
TÀI LIỆU THAM KHẢO NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN

16. Nguyễn Văn Hưng, Nguyến Việt Hải, Nguyễn Thụy Linh (2004). Nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học của ung thư tuyến tiền liệt. Tạp chí
Y dược học quân sự, 5. 67-71.
17. Vũ Quang Huy, Nguyễn Thi Hồng Nhung (2010). Đánh giá độ chính xác, chất lượng của kỹ thuật PSA và sơ bộ thăm dò giá trị trong chẩn đoán nguy cơ ung thư tuyến tiền liệt kết hợp với nội soi sinh thiết. Y học thực hành. 704(2). 43-47.
20. Lê Ngọc Bằng (2005). Vai trò của sinh thiết kết hợp với PSA và siêu âm trong chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt. Luận văn Thạc sĩ Y học. Trường Đại học Y Hà Nội.
21. Nguyễn Văn Hưng (2005). Nghiên cứu mô bệnh học quá sản lành tính, tân sản nội biểu mô và ung thư biểu mô tuyến tiền liệt. Luận án Tiến sĩ y học. Trường Đại học Y Hà Nội.

67. Đỗ Thị Khánh Hỷ (2003). Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của u phì đại tuyến tiền liệt và đánh giá vai trò của PSA huyết thanh trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh. Luận án tiến sĩ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội.
68. Hoàng Thị Phương Liên (2007). Nhận xét một số yếu tố ảnh hưởng tới nồng độ PSA huyết thanh ở bệnh nhân phì đại tuyến tiền liệt. Luận văn thạc sĩ Y học. Trường Đại học Y Hà Nội.
69. Nguyễn Thị Phương Ngọc ( 2009). Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học, chỉ số sinh hóa và mức độ biểu hiện gen HIP trong u tuyến tiền liệt. Luận án Tiến sĩ Y học. Trường Đại học dược Hà Nội.
70. Lê Quang Huấn (2011). Nghiên cứu kháng nguyên biểu hiện sớm, đặc hiệu ung thư tuyến tiền liệt (EPCA) để tạo kít chẩn đoán. Đề tài cấp bộ công nghệ sinh học.
71. Nguyễn Đình Bảng, Nguyễn Lĩnh Toàn, Hồ Anh Sơn và cs (2011). Nghiên cứu tạo khối ung thư người trên chuột và đánh giá độ tập trung của thuốc kháng thể kháng nhân gắn iod phóng xạ vào khối ung thư. Tạp chí Y- Dược học Quân sự, 51(4), 53-59
72. Hồ Anh Sơn, Bùi Khắc Cường, Li Feng Zhang và cs (2014). Nghiên cứu trị liệu ung thư tuyến tiền liệt bằng phối hợp hai oncolytic virus Sởi (Measle) và quai bị (Mump) trên thực nghiệm. Tạp chí Y- Dược học Quân sự, 2 – Kết quả nghiên cứu chương trình KHCN KC.10/11-15.
73. Trường Đại học Y Hà Nội (2007) Sinh lí bệnh- Miễn dịch, Nhà xuất bản Y học, Hà nội.
74. Kohler.G, Milstein C (1975). Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 256, 495-497.
75. Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung (2007). Giáo trình Công nghệ DNA tái tổ hợp. NXB Đại học Quốc gia, TP Hồ Chí Minh.
79. Nguyễn Hoàng Lộc (2007) Giáo trình nhập môn công nghệ sinh học, chương 6, Nhà xuất bản Đại học Huế.
80. Lê Thanh Hòa (2005). Sinh học phân tử: Nguyên lý và ứng dụng. Tài liệu giảng dạy sau đại học, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia.
81. Bộ môn Sinh lí bệnh (1981). Những kĩ thuật cơ bản dùng trong miễn dịch học tập1, Nhà xuất bản Y học, 95- 116.
84. Tạ Thành Văn (2010). PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
85. Phạm Hùng Vân (2009). PCR và realtime-PCR các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
86. Kim E.K, Moon J.C, Lee J.M, et al (2012). Large-scale production of soluble recombinant amyloid-P peptide 1-42 using cold-inducible expression system. Protein Expression and Purification, 86 (1), 53-7.
87. Trần Ngọc Tân, Đỗ Thị Huyền, Trương Nam Hải (2007). Biểu hiện gen Neuraminidase mã hóa cho phần epitope kháng nguyên (NAE) của virus cúm A/H5N1 trong tế bào E. coli. Tạp chí Công nghệ sinh học, 5(1), 25-30.Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN 3
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIÊT 3
1.1.1. Tình hình ung thư tuyến liền liệt trên thế giới 3
1.1.2. Tình hình ung thư tuyến tiền liệt tại Việt Nam 4
1.1.3. Yều cầu trong chẩn đoán và điều trị UTTTL 5
1.2. CÁC HIỂU BIẾT VỀ CHẨN ĐOÁN UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT 6
1.2.1. Các phương pháp truyền thống chẩn đoán UTTTL 6
1.2.2. Các hiểu biết mới trong chẩn đoán và điều trị UTTTL 10
1.3. KHÁNG THỂ VÀ CHẨN ĐOÁN UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT .. 29
1.3.1. Kháng thể 29
1.3.2. Kháng thể đơn dòng 35
1.4. CÁC KĨ THUẬT SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 40
1.4.1. Kĩ thuật tái tổ hợp DNA 40
1.4.2. Kĩ thuật tạo kháng thể bằng gây miễn dịch trên động vật 46
1.4.3. Kĩ thuật phân lập albumine từ huyết thanh 48
1.4.4 Kĩ thuật ELISA 49
CHƯƠNG 2:ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 55
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 55
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu của mục tiêu tạo kháng thể đặc hiệu kháng
nguyên UTTTL 55
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu tạo bộ sinh phẩm bằng kháng thể và bước đầu ứng dụng trong chẩn đoán UTTTL 55
2.2. HÓA CHẤT, SINH PHẨM NGHIÊN CỨU 56
2.2.1. Sinh phẩm 56
2.2.2. Hóa chất 56
2.3. TRANG THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 57
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 57
2.5. PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ KẾT QUẢ TRONG NGHIÊN CỨU 57
2.6. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU 58
2.8. CÁC KĨ THUẬT SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 58
2.8.1. Tạo kháng nguyên tái tổ hợp mang các epitope EPCA-2 59
2.8.2. Các kĩ thuật sử dụng gây miễn dịch cho thỏ tạo kháng thể đặc hiệu
kháng EPCA-2.22,2.19 75
2.8.3. Kĩ thuật ELISA xác định EPCA-2 82
2.9. ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU 84
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 85
3.1. TẠO GEN TÁI TỔ HỢP MANG CÁC EPITOPE EPCA-2 BằNG
PHƯƠNG PHÁP TÁI TỔ HỢP 85
3.1.1. Tạo vector tái tổ hợp mang gen polEPCA-2 85
3.1.2. Biểu hiện vector tái tổ hợp trong vi khuẩn E.coli chủng BL21 (DE3) 93
3.2. KẾT QUẢ GÂY MIỄN DỊCH Ở THỎ BẰNG KHÁNG NGUYÊN TÁI
TỔ HỢP PolEPCA-2 104
3.2.1. Nồng độ kháng thể kháng polEPCA-2 ở huyết thanh thỏ 104
3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH EPCA-2 TRONG HUYẾT THANH 3 NHÓM NGHIÊN CỨU
3.3.1. Thông tin chung của nhóm bệnh nhân tuyến tiền liệt 108
3.3.2. Nồng độ EPCA-2 trong huyết thanh 2 nhóm bệnh nhân tuyến tiền liệt
được định lượng bằng kháng thể thỏ kháng EPCA-2 và kít CUSABIO 111
3.3.3. Nồng độ EPCA- 2 trong huyết thanh nam giới khỏe mạnh 114
3.3.4. So sánh độ nhậy, độ đặc hiệu của kháng thể thỏ đặc hiệu kháng EPCA-
2 với kháng thể trong kít xác định EPCA-2 của CUSABIO 114
CHƯƠNG 4:BÀN LUẬN 116
4.1. VỀ THIẾT KẾ GEN MÃ HÓA POLYEPITOPE CỦA KHÁNG
NGUYÊN UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT SỚM 116
4.1.1. Lựa chọn biểu hiện các epitope của kháng nguyên thay vì biểu hiện
toàn bộ phân tử kháng nguyên 116
4.1.2. Thiết kế lặp nhiều lần trình tự các epitope 118
4.1.3. Thiết kế gen polEPCA-2 có trình tự nhận biết của các enzyme cắt
giới hạn 119
4.1.4. Tạo vector tái tổ hợp mang gen polEPCA-2 120
4.1.5. Biểu hiện protein tái tổ hợp 121
4.2. VỀ KẾT QUẢ TẠO KHÁNG THỂ THỎ ĐẶC HIỆU KHÁNG
PolEPCA-2 124
4.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH EPCA-2 TRONG HUYẾT THANH 3 NHÓM
NGHIÊN CỨU 128
4.3.1. Một số thông tin của 2 nhóm bệnh nhân tuyến tiền liệt 128
4.3.2. Kết quả xác định EPCA-2 trong huyết thanh bệnh nhân ung thư
tuyến tiền liệt bằng kháng thể thỏ có đối chứng với kít thương phẩm 130
4.3.3. Kết quả xác định EPCA-2 trong huyết thanh bệnh nhân u phì đại lành
tính tuyến tiền liệt và nam giới bình thương bằng 2 phương pháp ELISA 132
4.3.4. So sánh độ nhậy, độ đặc hiệu của 2 phương pháp ELISA sử dụng
kháng thể thỏ đặc hiệu kháng EPCA-2.22,2.19 và kháng thể trong kít xác định EPCA-2 của CUSABIO 134
KẾT LUẬN 135
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
Bảngl. 1: Trình tự acid amin ba epitop của EPCA-2 16
Bảng 1.2: Cấu trúc các globulin 30
Bảng 2.1. Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt bằng enzyme 60
Bảng 2.2. Hỗn hợp phản ứng gắn bằng enzyme 63
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR 67
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 67
Bảng 2.5. Công thức pha gel tách 70
Bảng 2.6. Công thức pha gel cô 71
Bảng 2.7. Công thức chia nhóm và dung dịch tiêm mẫn cảm 79
Bảng 3.1. Nồng độ IPTG và thời gian khảo sát sự biểu hiện protein tái tổ
hợp 96
Bảng 3.2: Các nồng độ EPCA-2 của đường chuẩn Kít ELISA (CSB-EQ
027679HU 102
Bảng 3.3. Nồng độ kháng thể kháng polEPCA-2 ở huyết thanh thỏ sau
tiêm mũi 3 105
Bảng 3.4. Nồng độ kháng thể kháng polEPCA-2 ở huyết thanh thỏ sau
tiêm mũi 3 và 4 105
Bảng 3.5. So sánh nồng độ kháng thể kháng polEPCA-2 ở huyết thanh thỏ
ngày thứ 15 và ngày thứ 20 sau tiêm mũi 4 107
Bảng 3.6. Nồng độ kháng thể kháng polEPCA-2 ở huyết thanh thỏ 20 ngày
sau tiêm mũi 4 ở các độ pha loãng khác nhau 107
Bảng 3.7. Phân bố tuổi ở nhóm bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt 108
Bảng 3.8. Phân bố tuổi ở nhóm bệnh nhân u phì đại tuyến tiền liệt 109
Bảng 3.9. Nồng độ tPSA trung bình trong huyết thanh các nhóm nghiên
cứu 110
Sự phân bố các mức nồng độ tPSA ở 3 nhóm nghiên cứu 110
Nồng độ EPCA-2 trong huyết thanh bệnh nhân ung thư tuyến
tiền liệt ở các mức nồng độ 111
Giá trị trung bình nồng độ EPCA-2 trong huyết thanh bệnh nhân
ung thư tuyến tiền liệt 111
Nồng độ EPCA-2 trong huyết thanh bệnh nhân u phì đại lành
tính tuyến tiền liệt 112
So sánh giá trị trung bình của nồng độ EPCA-2 và tPSA trong
huyết thanh bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt 113
Nồng độ EPCA-2 trong huyết thanh người nam bình thường định
lượng bằng KT thỏ đặc hiệu kháng EPCA-2 và Kit ELISA 114
So sánh độ nhậy của kháng thể thỏ đặc hiệu kháng EPCA-2 với
Kit ELISA ở nhóm bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt 114
So sánh độ đặc hiệu của kháng thể thỏ đặc hiệu kháng polEPCA-2 với kít ELISA ở nhóm bệnh nhân u phì đại lành tính TTL 114
Hình 1.1: Phân độ mô học theo Gleason 9
Hình 1.2: Mô tả nguyên lý hoạt động của siêu âm cắt lớp 12
Hình 1.3: Hình ảnh ung thư tuyến tiền liệt chụp PET/CT 14
Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc một hệ dẫn thuốc trong điều trị trúng đích 25
Hình 1.5: Các phần V và C của một đơn vị Ig 31
Hình 1.6: Cấu trúc của TCR 32
Hình 1.7: Cầu S-S, các domain và các mảnh phân tử Ig 32
Hình1.8: Cắt phân tử IgG với papain thu được: 2 mảnh Fab, 1 mảnh Fc… 33
Hình1.9: Cắt phân tử IgG với pepsin thu được: 1 mảnh F(ab)2 , 1 mảnh Fc’ 34
Hình 1.10: Sơ đồ tạo kháng thể bằng phương pháp tạo tế bào lai 37
Hình 1.11. Hai loại kháng thể đơn dòng 38
Hình 1.12: Sơ đồ tạo kháng thể đơn dòng ghép 38
Hình 1.13: Sơ đồ phương pháp sắc kí ái lực 45
Hình 1.14: Sơ đồ phương pháp ELISA trực tiếp 51
Hình 1.15: Sơ đồ phương pháp ELISA gián tiếp 51
Hình 1.16: Sơ đồ phương pháp ELISA sandwich 52
Hình 1.17: Sơ đồ phương pháp ELISA cạnh tranh ức chế 54
Hình 3.1. Trình tự gen polEPCA-2 86
Hình 3.2. Sơ đồ tạo vector biểu hiện tái tổ hợp 86
Hình 3.3. Kết quả cắt gen polEPCA-2 và pET-28a(+) bằng 2 enzym Nco I và Not I 87 Hình 3.4. Kiểm tra sản phẩm tinh sạch gen polEPCA-2 và pET-28a(+)với 2
đầu dính tương ứng 88
Hình 3.5. Đĩa biến nạp vector biểu hiện tái tổ hợp pET28a(+)/polEPCA-
2vào vi khuẩn E. coli chủng DH5a 89
Hình 3.6. Kết quả PCR với cặp mồi T7F/R 90
Một đoạn kết quả giải trình tự gen polEPCA-2 91
Trình tự gen polEPCA-2 trong vector pET-28a(+)và trình tự acid
amin suy diễn 92
Đĩa biến nạp vector biểu hiện tái tổ hợp pET-28a(+)/polEPCA-2
vào tế bào E. coli chủng BL21 (DE3) 93
Kiểm tra sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong E.coli BL21 94
Kiểm tra sự biểu hiện protein tái tổ hợp ở các nồng độ IPTG theo
thời gian 97
Kiểm tra sự biểu hiện protein tái tổ hợp ở các nhiệt độ khác nhau 98
Kiểm tra độ hòa tan của protein tái tổ hợp 99
Kiểm tra độ hòa tan của protein tái tổ hợp ở các nhiệt độ khác nhau 100
Kiểm tra sản phẩm tinh sạch protein polEPCA-2 101
Biểu đồ đường chuẩn kit 103
ELISA xác định nồng độ protein polEPCA-2 trong mẫu phân tích 104
Sự phân bố tuổi ở 2 nhóm bệnh nhân tuyến tiền liệt 108
Nồng độ tPSA ở 2 nhóm bệnh nhân tuyến tiền liệt 109
Cấu trúc acid amin prolin 119