Nghiên cứu tạo nguyên liệu tinh bột mì acetat đề kháng với enzym amylase dùng hỗ trợ điều trị các rối loạn chuyển hoá

Luận án tiến sĩ dược học Nghiên cứu tạo nguyên liệu tinh bột mì acetat đề kháng với enzym amylase dùng hỗ trợ điều trị các rối loạn chuyển hoá. Tình trạng rối loạn chuyển hoá đặc biệt là bệnh béo phì và đái tháo đường týp 2 đang gia tăng trên toàn thế giới. Năm 2021, ước tính có khoảng 537 triệu người trưởng thành mắc đái tháo đường, con số này được dự đoán sẽ tăng lên 783 triệu người vào năm 2045. Tỷ lệ tử vong do đái tháo đường cũng đáng báo động, đã có 6,7 triệu ca tử vong trong năm 20211. Năm 2019, tại Việt Nam có khoảng 3,8 triệu người mắc đái tháo đường týp 21. Bệnh béo phì cũng gia tăng gần gấp đôi kể từ năm 1980 và dự đoán đến năm 2030, cứ 5 phụ nữ thì có 1 và 7 nam giới sẽ có 1 người mắc bệnh béo phì. Béo phì cũng là nguyên nhân làm gia tăng 30-53% số ca mắc đái tháo đường mới mỗi năm2.

Điều chỉnh lối sống, đặc biệt là điều chỉnh chế độ ăn đóng vai trò quan trọng trong điều hoà cân bằng các rối loạn chuyển hoá3. Kiểm soát năng lượng tiêu thụ ở bệnh nhân béo phì cũng như kiểm soát tốt đường huyết sau ăn ở bệnh nhân đái tháo đường làm giảm các biến chứng kèm theo, đặc biệt là biến chứng trên tim mạch4.
Chuyển hóa glucose là một quá trình quan trọng để duy trì cân bằng năng lượng và chức năng sinh lý bình thường của tế bào với các cơ chế liên quan đến hấp thụ glucose, tổng hợp glycogen, phân giải glycogen, phân giải đường và chu trình acid tricarboxylic. Chuyển hóa lipid cũng đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cân bằng nội môi tế bào và cân bằng năng lượng, liên quan đến quá trình tổng hợp, lưu trữ, phân hủy và sử dụng lipid. Sự rối loạn của các quá trình này có thể dẫn đến nhiều bệnh khác nhau trong đó có bệnh béo phì, đái tháo đường týp 25.
Tinh bột đề kháng có khả năng hạn chế sự thủy phân của enzym tiêu hóa tại ruột non, giảm hình thành glucose sau bữa ăn, giảm đáp ứng glucose-insulin sau ăn, giảm năng lượng tiêu thụ, các đặc điểm này có tác động trực tiếp đến chuyển hoá glucose và chuyển hoá lipid. Hơn thế nữa, các acid béo mạch ngắn là sản phẩm của quá trình tiêu hoá tinh bột đề kháng cũng đóng vai trò quan trọng vào quá trình duy trì cân bằng glucose-lipid nội môi tế bào và cân bằng năng lượng, mang lại lợi ích sức khoẻ cho bệnh béo phì, đái tháo đường týp 26,7.
Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu trên mô hình động vật cũng như trên lâm sàng đã chứng minh được tác động có lợi của tinh bột đề kháng trên chuyển hoá glucose và chuyển hoá lipid giúp điều chỉnh cân bằng glucoselipid nội môi tế bào và cân bằng năng lượng7. Hiện nay, trên thị trường một số sản phẩm chứa tinh bột đề kháng như VERSAFIBE™ 1490 có nguồn gốc từ tinh bột khoai tây biến đổi hoá học, VERSAFIBE™ 2470 từ tinh bột bắp biến đổi hoá học, NOVELOSE 3490 có nguồn gốc từ tinh bột sắn biến đổi hoá học là các nguyên liệu thực phẩm chứa hàm lượng tinh bột đề kháng cao được thương mại hóa rộng rãi với tính năng là các sản phẩm làm giảm đường sau ăn và cung cấp năng lượng thấp8-11.
Cùng với sự phát triển của ngành thực phẩm và dược phẩm, việc mở rộng nghiên cứu về tinh bột đề kháng vẫn là một hướng đi đầy tiềm năng. Các nghiên cứu về tinh bột đề kháng hầu hết tập trung vào so sánh, đánh giá các phương pháp, tác nhân tạo tinh bột đề kháng để thu được hàm lượng tinh bột đề kháng cao; các nghiên cứu cũng chỉ ra hàm lượng tinh bột đề kháng có mối quan hệ tương quan với lợi ích sức khoẻ.
Lương thực lúa mì có sản lượng lớn trên thế giới, mức tiêu thụ cao, giá thành rẻ là những điểm thuận lợi để lựa chọn nghiên cứu. Cho đến nay, tinh bột lúa mì đã được biến đổi cấu trúc tạo tinh bột đề kháng bởi nhiều loại tác nhân hoá học khác nhau và được sử dụng trong các ngành công nghiệp như giấy, dệt may, phụ gia thực phẩm12,… Anhydrid acetic là một trong những tác nhân hoá học được FDA khuyến cáo dùng trong biến đổi cấu trúc hoá học tinh bột, trước đây, anhydrid acetic đã được dùng để biến đổi cấu trúc phân tử các loại tinh bột như tinh bột gạo, tinh bột ngô hoặc tinh bột kiều mạch. Tuy nhiên, đối với tinh bột lúa mì, anhydrid acetic vẫn chưa được đề cập nghiên cứu tạo sản phẩm tinh bột lúa mì acetat. Với mong muốn nghiên cứu tạo nguyên liệu thực phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng, đánh giá tính an toàn và chứng minh tác động tích cực trên chuyển hoá glucose, lipid đồng thời góp phần mở rộng cơ sở dữ liệu, tạo tiền đề cho sự phát triển sản phẩm ứng dụng hỗ trợ sức khoẻ, đề tài luận án “Nghiên cứu tạo nguyên liệu tinh bột mì acetat đề kháng với enzym amylase dùng hỗ trợ điều trị các rối loạn chuyển hoá” được thực hiện với 5 mục tiêu sau:
1. Điều chế và xác định đặc tính lý, hóa của tinh bột lúa mì (Amylum tritici) acetat.
2. Đánh giá khả năng đề kháng enzym amylase in vitro của tinh bột lúa mì (Amylum tritici) acetat.
3. Đánh giá tính an toàn của tinh bột lúa mì (Amylum tritici) acetat trên động vật thực nghiệm.
4. Đánh giá tác dụng của tinh bột lúa mì (Amylum tritici) acetat trên chuột béo phì và chuột béo phì kèm tăng đường huyết.
5. Khảo sát sản phẩm chuyển hóa – các acid béo mạch ngắn của tinh bột lúa mì (Amylum tritici) acetat trong ruột già của chuột thí nghiệm

MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT………………………………………………………………. i
DANH MỤC HÌNH ……………………………………………………………………………. vi
DANH MỤC BẢNG …………………………………………………………………………… ix
DANH MỤC SƠ ĐỒ………………………………………………………………………….. xii
CÁC ĐIỂM MỚI CỦA CÔNG TRÌNH……………………………………………….. xiv
ĐẶT VẤN ĐỀ ……………………………………………………………………………………. 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………………… 4
1.1. Tinh bột lúa mì …………………………………………………………………………….. 4
1.2. Tinh bột đề kháng…………………………………………………………………………. 9
1.3. Vai trò của tinh bột đề kháng trên các rối loạn chuyển hoá ………………. 19
1.4. Các nghiên cứu về tinh bột đề kháng tại Việt Nam và trên thế giới …… 22
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………. 36
2.1. Thiết kế nghiên cứu…………………………………………………………………….. 36
2.2. Đối tượng nghiên cứu………………………………………………………………….. 37
2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu …………………………………………………. 37
2.4. Dung môi, hóa chất và trang thiết bị, dụng cụ………………………………….. 38
2.5. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………………………… 42
2.6. Phương pháp phân tích số liệu ……………………………………………………… 73
2.7. Đạo đức trong nghiên cứu ……………………………………………………………. 74
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………………….. 76
3.1. Điều chế và xác định đặc tính lý, hóa của tinh bột lúa mì acetat………… 763.2. Khả năng đề kháng enzym amylase in vitro của tinh bột lúa mì acetat . 88
3.3. Độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của tinh bột lúa mì acetat ….. 90
3.4. Đánh giá tác dụng của tinh bột lúa mì acetat trên chuột béo phì và chuột
béo phì, tăng đường huyết ……………………………………………………………. 96
3.5. Xác định thành phần các acid béo mạch ngắn có trong ruột già chuột ăn
tinh bột lúa mì acetat …………………………………………………………………. 108
Chương 4. BÀN LUẬN …………………………………………………………………… 114
4.1. Điều chế và xác định đặc tính lý, hóa của tinh bột lúa mì acetat ……… 114
4.2. Khả năng đề kháng enzym amylase in vitro của tinh bột lúa mì acetat 119
4.3. Độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của tinh bột lúa mì acetat … 121
4.4. Ảnh hưởng của tinh bột lúa mì acetat trên chuột béo phì và béo phì tăng
đường huyết……………………………………………………………………………… 123
4.5. Thành phần các acid béo mạch ngắn có trong ruột già chuột ăn tinh bột
lúa mì acetat……………………………………………………………………………… 130
4.6. Lợi ích sức khỏe của tinh bột lúa mì acetat trên các rối loạn chuyển hoá
……………………………………………………………………………………………….. 132
KẾT LUẬN ……………………………………………………………………………………. 137
KIẾN NGHỊ …………………………………………………………………………………… 138
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ ………………… 139
TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hạt lúa mì; tinh bột lúa mì; cấu trúc amylose và amylopectin……… 5
Hình 1.2. Quy trình tinh chế tinh bột và tạo tinh bột đề kháng bằng phương
pháp hoá học………………………………………………………………………………… 6
Hình 1.3. Tác động của các enzym tiêu hóa lên chuỗi polysaccharid………….. 8
Hình 1.4. Vai trò của tinh bột đề kháng trong điều hòa cân bằng glucose-lipid
…………………………………………………………………………………………………. 21
Hình 2.1. Phản ứng acetyl hóa tinh bột lúa mì ……………………………………….. 44
Hình 3.1. Hàm lượng acetyl (%) và mức thay thế (Ds) của tinh bột lúa mì acetat
ở các thời gian phản ứng khác nhau ………………………………………………. 77
Hình 3.2. Hàm lượng acetyl (%) và mức thay thế (Ds) của tinh bột lúa mì acetat
ở các tỷ lệ anhydrid acetic khác nhau…………………………………………….. 78
Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của tinh bột lúa mì tự nhiên (a) và tinh bột lúa mì acetat
(b) trong DMSO-d6 …………………………………………………………………….. 80
Hình 3.4. Hình ảnh hạt tinh bột lúa mì tự nhiên và tinh bột lúa mì acetat dưới
kính hiển vi điện tử……………………………………………………………………… 84
Hình 3.5. Giản đồ nhiễu xạ tia X của tinh bột lúa mì tự nhiên và tinh bột lúa mì
acetat…………………………………………………………………………………………. 85
Hình 3.6. Đồ thị tương quan giữa nồng độ các dung dịch glucose chuẩn và độ
hấp thu ………………………………………………………………………………………. 89
Hình 3.7. Sự thay đổi thể trọng chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường
diễn ở các nhóm khác nhau ………………………………………………………….. 92
Hình 3.8. Hình ảnh vi thể mô gan chuột thử nghiệm ở độ phóng đại 100 lần 95vii
Hình 3.9. Hình ảnh vi thể mô thận chuột thử nghiệm ở độ phóng đại 100 lần
…………………………………………………………………………………………………. 95
Hình 3.10. Nồng độ glucose máu sau ăn của chuột béo phì ở các nhóm thử
nghiệm ………………………………………………………………………………………. 98
Hình 3.11. Thể trọng chuột béo phì ở các nhóm thử nghiệm tại các thời điểm
khác nhau…………………………………………………………………………………. 100
Hình 3.12. Nồng độ glucose trong máu của chuột béo phì ở các nhóm thử
nghiệm tại các thời điểm khác nhau …………………………………………….. 101
Hình 3.13. Nồng độ triglycerid máu sau 8 tuần ở chuột béo phì của các nhóm
thử nghiệm……………………………………………………………………………….. 102
Hình 3.14. Nồng độ cholesterol máu sau 8 tuần ở chuột béo phì của các nhóm
thử nghiệm……………………………………………………………………………….. 103
Hình 3.15. AUCglucose ở chuột béo phì trong thử nghiệm dung nạp glucose và
dung nạp insulin của các nhóm thử nghiệm khác nhau sau 8 tuần thử
nghiệm …………………………………………………………………………………….. 104
Hình 3.16. Nồng độ glucose của chuột béo phì và tăng đường huyết ở các nhóm
khác nhau sau 8 tuần thử nghiệm ………………………………………………… 106
Hình 3.17. Mức HbA1c của nhóm AC5 và AC10 trên chuột béo phì và tăng
đường huyết sau 8 tuần thử nghiệm …………………………………………….. 107
Hình 3.18. AUCglucose sau 120 phút của các nhóm thử nghiệm dung nạp glucose
ở chuột béo phì và tăng đường huyết sau 8 tuần thử nghiệm…………… 107
Hình 3.19. Sắc ký đồ mẫu chuẩn (A) và mẫu phân của chuột ăn tinh bột lúa mì
acetat (B), mẫu phân của chuột ăn tinh bột lúa mì tự nhiên (C)……….. 111viii
Hình 4.1. Cơ chế lý thuyết mô phỏng về tác dụng của tinh bột lúa mì acetat
(tinh bột đề kháng) trên chuột béo phì kèm tăng đường huyết bằng
streptozotocin …………………………………………………………………………… 130ix
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại tinh bột đề kháng theo đặc điểm cấu tạo…………………… 10
Bảng 1.2. Mức thay thế của một số tinh bột đề kháng …………………………….. 12
Bảng 1.3. Các phương pháp tổng hợp tinh bột đề kháng bằng phương pháp hóa
học và giới hạn hàm lượng nhóm thế theo yêu cầu của FDA ……………. 13
Bảng 1.4. Độ trương nở của một số tinh bột đề kháng tạo bởi phương pháp hoá
học ……………………………………………………………………………………………. 16
Bảng 1.5. Các đặc tính nhiệt của một số tinh bột đề kháng tạo bởi phương pháp
hoá học ……………………………………………………………………………………… 17
Bảng 1.6. Một số nghiên cứu nước ngoài về tinh bột đề kháng và lợi ích đối với
sức khỏe…………………………………………………………………………………….. 24
Bảng 1.7. Một số nghiên cứu về tinh bột lúa mì biến đổi bằng phương pháp hóa
học ……………………………………………………………………………………………. 33
Bảng 2.1. Danh mục hóa chất, dụng cụ, thiết bị nghiên cứu…………………….. 38
Bảng 2.2. Các chỉ tiêu chất lượng của tinh bột lúa mì acetat ……………………. 48
Bảng 2.3. Các dấu hiệu theo dõi tình trạng sinh lý của chuột trong thử nghiệm
độc tính bán trường diễn………………………………………………………………. 57
Bảng 2.4. Xác định công thức máu, chức năng gan, thận sau 8 tuần thử nghiệm
độc tính bán trường diễn của tinh bột lúa mì acetat …………………………. 58
Bảng 3.1. Khối lượng tinh bột lúa mì tinh chế và tinh bột lúa mì acetat thu được
sau phản ứng acetyl hóa ………………………………………………………………. 76
Bảng 3.2. Kết quả kiểm nghiệm chất lượng sản phẩm tinh bột lúa mì acetat 81
Bảng 3.3. Thông số nhiệt động học của quá trình gelatin hóa tinh bột lúa mì tự
nhiên và tinh bột lúa mì acetat………………………………………………………. 86x
Bảng 3.4. Độ trương nở và độ hòa tan của tinh bột lúa mì tự nhiên và tinh bột
lúa mì acetat……………………………………………………………………………….. 86
Bảng 3.5. Các đặc điểm lý, hoá của tinh bột lúa mì acetat……………………….. 87
Bảng 3.6. Tiêu chuẩn cơ sở của tinh bột lúa mì acetat…………………………….. 88
Bảng 3.7. Nồng độ glucose của tinh bột lúa mì tự nhiên và tinh bột lúa mì acetat
trong thử nghiệm in vitro……………………………………………………………… 89
Bảng 3.8. Hàm lượng tinh bột tiêu hóa (DS) và tinh bột đề kháng (RS) trong
tinh bột lúa mì acetat và tinh bột lúa mì tự nhiên…………………………….. 90
Bảng 3.9. Các dấu hiệu về tình trạng sinh lý của chuột sau 8 tuần thử nghiệm
độc tính bán trường diễn………………………………………………………………. 91
Bảng 3.10. Số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu của các chuột sau 8 tuần thử
nghiệm độc tính bán trường diễn…………………………………………………… 93
Bảng 3.11. Chỉ số AST, ALT, ure, creatinin và albumin của các chuột sau 8
tuần thử nghiệm độc tính bán trường diễn ……………………………………… 94
Bảng 3.12. Đặc điểm mô gan của các chuột ở nhóm AC15 sau 8 tuần thử
nghiệm độc tính bán trường diễn…………………………………………………… 95
Bảng 3.13. Đặc điểm mô thận của các chuột ở nhóm AC15 sau 8 tuần thử
nghiệm độc tính bán trường diễn…………………………………………………… 96
Bảng 3.14. Các chỉ số chuyển hóa ở chuột ăn chế độ ăn giàu chất béo ……… 97
Bảng 3.15. Giá trị AUCglucose sau 120 phút ở các nhóm thử nghiệm………….. 98
Bảng 3.16. Nồng độ insulin và chỉ số Homa-IR trên chuột béo phì của các nhóm
sau 8 tuần thử nghiệm………………………………………………………………… 104
Bảng 3.17. Mức tăng đường huyết trên chuột béo phì sau khi gây tăng đường
huyết bằng streptozotocin…………………………………………………………… 105xi
Bảng 3.18. Kết quả thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định
lượng các acid béo mạch ngắn ……………………………………………………. 110
Bảng 3.19. Hàm lượng các acid béo mạch ngắn trong phân chuột ở các phân
đoạn tiêu hóa của chuột thử nghiệm sau 20 ngày…………………………… 11