Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài Hippeastrum reticulatum (L’Hér.) Herb. ở Việt Nam

Luận án tiến sĩ dược học Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài Hippeastrum reticulatum (L’Hér.) Herb. ở Việt Nam.Alzheimer là bệnh lý phổ biến nhất trong các hội chứng sa sút trí tuệ, thường gặp ở người cao tuổi. Theo số liệu thống kê năm 2019 của World Alzheimer Report, có 50 triệu người mắc sa sút trí tuệ trên toàn thế giới, trong đó 60-80% trường hợp mắc bệnh Alzheimer1. Tỷ lệ mắc mới tăng 5-7 triệu người mỗi năm, ước tính sẽ có khoảng 115 triệu người mắc bệnh vào năm 20502. Tổng chi phí cho việc chăm sóc và điều trị bệnh Azheimer vào khoảng 345 tỉ USD, con số này sẽ tăng lên 1 nghìn tỉ vào năm 2050. Các con số này cho thấy sự gia tăng và mức độ đe dọa đáng kể của bệnh Azheimer đối với xã hội hiện nay. Mặc dù đây là căn bệnh có mức độ phổ biến cao và nguy hiểm như vậy nhưng từ khi bệnh này được phát hiện và mô tả vào năm 1906, cho đến nay, chỉ có 6 thuốc được FDA chấp thuận sử dụng trong điều trị Alzheimer. Do đó, nghiên cứu và phát triển thuốc điều trị bệnh Alzheimer là nhu cầu cấp thiết hiện nay.

Các thuốc từ tự nhiên đóng vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu và phát triển thuốc điều trị Alzheimer hiện nay. Nổi bật là các hợp chất rivastigmin, galatamin và huperzin A. Trong đó, rivastigmin và galantamin đã được FDA chấp thuận sử dụng làm thuốc và huperzin A sử dụng làm thực phẩm chức năng trong điều trị bệnh Alzheimer 3. Các hợp chất này đều có tác dụng điều trị bệnh Alzheimer dựa trên cơ chế ức chế acetylcholinesterase (AChE). Chính vì vậy, việc tìm kiếm các hợp chất có tác dụng ức chế AChE từ tự nhiên được xem là một hướng đi tiềm năng trong việc nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer.
Theo đánh giá của các nhà khoa học, các alcaloid thực vật đặc biệt từ họ Amaryllidaceae (nơi cung cấp galantamin) là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho việc phát hiện và khai thác các thuốc mới trong việc phòng và hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer. Hippeastrum Herb. là một chi lớn trong họ Amaryllidaceae với khoảng 111 loài đã được ghi nhận4. Chi này đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây với nhiều công bố cho thấy nhiều loài trong chi
2
cũng như các hợp chất được phân lập có hoạt tính sinh học tốt, đặc biệt là tác dụng ức chế AChE.
Theo Thực vật chí Việt Nam, chi Hippeastrum ở Việt Nam có 2 loài là Hippeastrum equestre và Hippeastrum reticulatum5. Kết quả sàng lọc ban đầu của nhóm nghiên cứu cho thấy cả hai loài Hippeastrum equestre và Hippeastrum reticulatum đều có tác dụng ức chế AChE với giá trị IC50 tương ứng là 59,09 ± 2,43 và 39,85 ± 0,94 µg/ml. Từ kết quả sàng lọc này có thể thấy loài Hippeastrum reticulatum có tác dụng tốt hơn. Cho đến thời điểm luận án được thực hiện (năm 2017), trên thế giới mới chỉ có 3 công bố về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của loài Hippeastrum reticulatum. Như vậy, việc nghiên cứu loài Hippeastrum reticulatum (L’Hér.) Herb. ở Việt Nam để tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính ức chế AChE có khả năng đạt được kết quả mới và là một bước khởi đầu cần thiết cho việc nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer từ nguồn tài nguyên trong nước. Chính vì những lý do đó chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng ức chế acetylcholinesterase của loài Hippeastrum reticulatum (L’Hér.) Herb. ở Việt Nam” với các mục tiêu sau:
Mục tiêu 1. Nghiên cứu thành phần hoá học của loài Hippeastrum reticulatum theo định hướng hoạt tính ức chế acetylcholinesterase.
Mục tiêu 2. Xây dựng quy trình định lượng hợp chất có trong loài Hippeastrum reticulatum.
Mục tiêu 3. Xác định độc tính cấp và đánh giá tác dụng sinh học của các cao toàn phần, cao phân đoạn và các hợp chất phân lập được theo hướng điều trị bệnh Alzheimer

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn …………………………………………………………………………………………………… i
Lời cam đoan……………………………………………………………………………………………….iii
Danh mục các chữ viết tắt và thuật ngữ Anh-Việt ……………………………………………. vi
Danh mục các bảng …………………………………………………………………………………….viii
Danh mục các hình……………………………………………………………………………………….. x
ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………………………………………….. 1
Chương 1. TỔNG QUAN …………………………………………………………………………… 3
1.1. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Hippeastrum Herb. ……………….3
1.2. Thành phần hoá học chi Hippeastrum Herb…………………………………………………………….5
1.3. Tổng quan các nghiên cứu về cây Hippeastrum reticulatum (L.Hér.) Herb. ……………26
1.4. Tổng quan về thuốc điều trị Alzheimer………………………………………………………………….27
1.5. Tổng quan một số mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm và phương pháp đánh giá
trong nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer …………………………………………………………………..29
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………….. 34
2.1. Thiết kế nghiên cứu ……………………………………………………………………………………………..34
2.2. Quy trình nghiên cứu……………………………………………………………………………………………34
2.3. Đối tượng nghiên cứu…………………………………………………………………………………………..35
2.4. Cỡ mẫu nghiên cứu………………………………………………………………………………………………36
2.5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu …………………………………………………………………………36
2.6. Hoá chất, thiết bị nghiên cứu…………………………………………………………………………………37
2.7. Phương pháp nghiên cứu, thu thập số liệu……………………………………………………………..39
2.8. Phương pháp phân tích dữ liệu ……………………………………………………………………………..54
Chương 3. KẾT QUẢ………………………………………………………………………………… 55
3.1. Kết quả nghiên cứu về thực vật …………………………………………………………………………….55
3.2. Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học……………………………………………………………63
3.3. Xây dựng quy trình định lượng 2-methoxy pancracin trong thân hành cây Hippeastrum
reticulatum bằng HPLC………………………………………………………………………………………………98v
3.4. Kết quả nghiên cứu độc tính cấp …………………………………………………………………………109
3.5. Kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học …………………………………………………………….110
Chương 4. BÀN LUẬN ……………………………………………………………………………. 119
4.1. Về đặc điểm thực vật ………………………………………………………………………………………….119
4.2. Về thành phần hoá học loài Hippeastrum reticulatum ………………………………………….122
4.3. Về quy trình định lượng 2-methoxy pancracin trong cây Hippeastrum reticulatum.127
4.4. Về độc tính cấp của loài Hippeatrum reticulatum ………………………………………………..130
4.5. Về tác dụng sinh học…………………………………………………………………………………………..132
KẾT LUẬN …………………………………………………………………………………………….. 147
KIẾN NGHỊ ……………………………………………………………………………………………. 149
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Các alcaloid thuộc khung lycorin được phân lập từ chi Hippeastrum……. 7
Bảng 1.2. Alcaloid khung homolycorin được phân lập từ chi Hippeastrum …………. 9
Bảng 1.3. Các alcaloid khung haemanthamin phân lập từ chi Hippeastrum ……….. 11
Bảng 1.4. Alcaloid khung crinin phân lập từ chi Hippeastrum………………………….. 13
Bảng 1.5. Alcaloid khung pretazettin phân lập từ chi Hippeastrum …………………… 14
Bảng 1.6. Alcaloid khung narciclasin phân lập từ chi Hippeastrum…………………… 15
Bảng 1.7. Alcaloid khung montanin phân lập từ chi Hippeastrum…………………….. 16
Bảng 1.8. Alcaloid khung galantamin phân lập từ chi Hippeastrum ………………….. 17
Bảng 1.9. Các alcaloid có khung cấu trúc khác phân lập từ chi Hippeastrum……… 18
Bảng 1.10. Một số test hành vi thường dùng trong đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ
của thuốc …………………………………………………………………………………………………… 31
Bảng 2.1. Thành phần hỗn hợp phản ứng đánh giá hoạt tính ức chế AChE ………… 46
Bảng 3.1. Kết quả một số chỉ tiêu khảo sát bột thân hành Hippeastrum reticulatum .. 63
Bảng 3.2. Kết quả định tính các nhóm chất bằng phản ứng hoá học ………………….. 63
Bảng 3.3. Hoạt tính ức chế AChE của các mẫu cao chiết từ thân hành của loài
Hippeastrum reticulatum……………………………………………………………………………… 66
Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của trans-dihydronarciclasin và hợp chất 1……………. 75
Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất 2……………………………………………………. 77
Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất 3 và narciprimin ……………………………… 79
Bảng 3.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất 4 và narciclasin-4-O-β-D-xylopyranosid 81
Bảng 3.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất 5 và 2-methoxy pancracin ………………… 83
Bảng 3.9. Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất 6 và N-methyltyramin…………………. 85
Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất 7 và 3β,11α-dihydroxy-1,2-dehydrocrinan 86
Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất 8 và brunsvigin……………………………… 88
Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất 9 và pancracin ………………………………. 90
Bảng 3.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất 10 và 8-O-demethylmaritidin………….. 91
Bảng 3.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất 11 và cycasinden …………………………… 92
Bảng 3.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất 12 và 2,3-cis-guibourtinidol ……………. 94
Bảng 3.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất 13 và 8-methylkaempferol ……………… 95ix
Bảng 3.17. Các hợp chất phân lập từ thân hành của loài Hippeastrum reticulatum 96
Bảng 3.18. Kết quả đánh giá độ tinh khiết của 2-methoxy pancracin…………………. 99
Bảng 3.19. Kết quả khảo sát dung môi chiết…………………………………………………. 101
Bảng 3.20. Kết quả khảo sát thời gian chiết………………………………………………….. 102
Bảng 3.21. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết…………………………………………………… 102
Bảng 3.22. Kết quả khảo sát số lần chiết ……………………………………………………… 103
Bảng 3.23. Kết quả khảo sát tính tương tích hệ thống ……………………………………. 104
Bảng 3.24. Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của 2-methoxy pancracin… 106
Bảng 3.25. Kết quả khảo sát độ lặp lại trong ngày và liên ngày của phương pháp định
lượng……………………………………………………………………………………………………….. 107
Bảng 3.26. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng…………………. 107
Bảng 3.27. Hàm lượng 2-methoxy pancracin có trong thân hành cây Hippeastrum
reticulatum thu hái ở Thừa Thiên Huế…………………………………………………………. 108
Bảng 3.28. Kết quả của bước dò liều độc tính ………………………………………………. 109
Bảng 3.29. Số chuột chết sau 72 giờ uống cao phân đoạn alcaloid cây Hippeastrum
reticulatum ở các liều khác nhau…………………………………………………………………. 109
Bảng 3.30. Hoạt tính ức chế AChE của các hợp chất phân lập được………………… 110
Bảng 3.31. Kết quả đánh giá tác dụng của cao phân đoạn alcaloid của loài
Hippeastrum reticulatum trên thử nghiệm mê lộ chữ Y …………………………………. 111
Bảng 3.32. Tỷ lệ thời gian khám phá các đồ vật ở pha luyện tập …………………….. 112
Bảng 3.33. Tỷ lệ thời gian khám phá các đồ vật ở pha kiểm tra………………………. 112
Bảng 3.34. Thời gian tiềm từ ngày 1 đến ngày 6 …………………………………………… 113
Bảng 3.35. Quãng đường chuột bơi đến bến đỗ từ ngày 1 đến ngày 6 ……………… 114
Bảng 3.36. Thời gian bơi trong góc phần tư đặt bến đỗ trước đó ở ngày 7 ……….. 115
Bảng 3.37. Hoạt độ của AChE ở hồi hải mã …………………………………………………. 115
Bảng 4.1. Đặc điểm hình thái của Lan huệ mạng và Lan huệ đỏ ở Việt Nam……. 120
Bảng 4.2. Phân loại độc tính của Hodge và Sterner143 ……………………………………. 131x
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Phân loại họ Amaryllidaceae………………………………………………………………………3
Hình 1.2. Các khung cấu trúc của alcaloid phân lập từ chi Hippeastrum. ……………………..6
Hình 1.3. Các alcaloid khung lycorin phân lập từ chi Hippeastrum………………………………9
Hình 1.4. Các alcaloid khung homolycorin phân lập từ chi Hippeastrum……………………11
Hình 1.5. Các alcaloid khung haemanthamin phân lập từ chi Hippeastrum…………………12
Hình 1.6. Alcaloid khung crinin phân lập từ chi Hippeastrum……………………………………13
Hình 1.7. Alcaloid khung pretazettin phân lập từ chi Hippeastrum …………………………….15
Hình 1.8. Alcaloid khung narciclasin phân lập từ chi Hippeastrum…………………………….16
Hình 1.9. Alcaloid khung montanin phân lập từ chi Hippeastrum………………………………16
Hình 1.10. Alcaloid khung galantamin phân lập từ chi Hippeastrum………………………….18
Hình 1.11. Các alcaloid phân lập từ chi Hippeastrum………………………………………………..19
Hình 1.12. Các hợp chất phân lập từ chi Hippeastrum……………………………………………….21
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình thực hiện của luận án………………………………………………………..35
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình thực hiện các thử nghiệm hành vi………………………………………48
Hình 2.3. Mê lộ chữ Y…………………………………………………………………………………………….49
Hình 2.4. Hộp nhận thức đồ vật……………………………………………………………………………….50
Hình 2.5. Mê lộ nước Morris …………………………………………………………………………………..51
Hình 3.1. Ảnh cây Hippeastrum reticulatum…………………………………………………………….55
Hình 3.2. Các đặc điểm hình thái của cây Hippeastrum reticulatum…………………………..56
Hình 3.3. Hoa đồ cây Hippeastrum reticulatum………………………………………………………..57
Hình 3.4. Cấu tạo giải phẫu lá cây Hippeastrum reticulatum……………………………………..58
Hình 3.5. Cấu tạo giải phẫu thân hành loài Hippeastrum reticulatum …………………………59
Hình 3.6. Cấu tạo giải phẫu rễ cây Hippeastrum reticulatum……………………………………..60
Hình 3.7. Đặc điểm bột lá Hippeastrum reticulatum………………………………………………….61
Hình 3.8. Đặc điểm bột thân hành của loài Hippeastrum reticulatum. ………………………..62
Hình 3.9. Đặc điểm bột rễ của loài Hippeastrum reticulatum …………………………………….63
Hình 3.10. Sơ đồ chiết xuất phần thân hành của cây Hippeastrum reticulatum……………66xi
Hình 3.11. Sơ đồ phân lập hợp chất 1, 2, 10 và 11. ……………………………………………………68
Hình 3.12. Sơ đồ phân lập hợp chất 3 và 9………………………………………………………………..69
Hình 3.13. Sơ đồ phân lập hợp chất 4 và 5………………………………………………………………..70
Hình 3.15. Sơ đồ phân lập hợp chất 7 và 8………………………………………………………………..72
Hình 3.16. Sắc ký đồ phân lập hợp chất 12……………………………………………………………….73
Hình 3.17. Sơ đồ phân lập hợp chất 12……………………………………………………………………..73
Hình 3.18. Sơ đồ phân lập hợp chất 13……………………………………………………………………..74
Hình 3.19. Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 ……………………………………………………………..76
Hình 3.20. Tương tác HMBC chính của hợp chất 1…………………………………………………..76
Hình 3.21. Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 ……………………………………………………………..78
Hình 3.22. Tương tác HMBC, COSY, NOESY chính của hợp chất 2 ………………………..78
Hình 3.23. Cấu trúc hóa học của hợp chất 3. …………………………………………………………….80
Hình 3.24. Cấu trúc hóa học của hợp chất 4 ……………………………………………………………..82
Hình 3.25. Tương tác HMBC chính của hợp chất 4…………………………………………………..82
Hình 3.26. Cấu trúc hóa học của hợp chất 5 ……………………………………………………………..84
Hình 3.27. Tương tác HMBC chính của hợp chất 5…………………………………………………..84
Hình 3.28. Cấu trúc hóa học của hợp chất 6 ……………………………………………………………..85
Hình 3.29. Cấu trúc hóa học của hợp chất 7. …………………………………………………………….87
Hình 3.30. Các tương tác NOESY chính của hợp chất 7……………………………………………87
Hình 3.31. Cấu trúc hóa học của hợp chất 8 ……………………………………………………………..89
Hình 3.32. Cấu trúc hóa học của hợp chất 9 ……………………………………………………………..90
Hình 3.33. Cấu trúc hóa học của hợp chất 10 ……………………………………………………………92
Hình 3.34. Cấu trúc hóa học của hợp chất 11 ……………………………………………………………93
Hình 3.35. Cấu trúc hóa học của hợp chất 12 ……………………………………………………………94
Hình 3.36. Cấu trúc hóa học của hợp chất 13 ……………………………………………………………96
Hình 3.37. Tương tác HMBC chính của hợp chất 13…………………………………………………96
Hình 3.38. Phổ UV của 2-methoxy pancracin. ………………………………………………………….99
Hình 3.39. Sắc ký đồ của một số hệ dung môi pha động đã khảo sát ………………………..101
Hình 3.40. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu………………………………………………………………105xii
Hình 3.41. Đường tuyến tính chuẩn 2-methoxy pancracin. ………………………………………106
Hình 3.42. Nồng độ MDA huyết tương ………………………………………………………………….116
Hình 3.43. Nồng độ SOD huyết tương……………………………………………………………………117
Hình 3.44. Nồng độ GSH-Px huyết tương………………………………………………………………118
Hình 4.1. Đặc điểm vi phẫu ở một số loài thuộc chi Hippeastrum…………………………….121
Hình 4.2. Cấu trúc hoá học của các hợp chất phân lập được từ cây Hippeastrum reticulatum
…………………………………………………………………………………………………………………………….12