Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng kháng ung thư của thân lá cây củ dòm

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng kháng ung thư của thân lá cây củ dòm (Stephania dielsiana Y. C. Wu).Chi Stephania Lour. thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae) có khoảng trên 100 loài trên thế giới, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, á nhiệt đới các nước châu Á. Một số loài trong chi Stephania Lour. đang là nguồn nguyên liệu chiết xuất một số hoạt chất làm thuốc như L-tetrahydropalmatin, cepharanthin, tetrandrin… Nhiều loài trong chi này được sử dụng làm thuốc phòng và chữa bệnh tùy theo kinh nghiệm của nhân dân từng địa phương. Loài Stephania dielsiana Y.C. Wu có tên thường dùng là củ dòm, ngoài ra còn có các tên khác như bình vôi nhựa tím, cà tòm, củ gà ấp [1], [2] là một trong các loài thuộc chi Stephania Lour. đang được quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây. Đây là một loài có phân bố tương đối hẹp, chủ yếu gặp ở miền bắc Việt Nam [2] và một số vùng miền Nam Trung Quốc (như Quảng Tây, Vân Nam) [3]. Nghiên cứu của các tác giả Trung Quốc chủ yếu tập trung vào việc chiết xuất, phân lập các hợp chất từ củ [3], [4], [5], [6] mà chưa quan tâm đến phần thân lá của loài này.
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về Stephania dielsiana Y.C. Wu đã xác định các đặc điểm thực vật [7]; phân lập và xác định cấu trúc của một số alcaloid có  trong thân lá và củ của cây như L-tetrahydropalmatin, oxostephanin,dehydrocrebanin, thailandin, crebanin [8], [5], [10], [11]; xây dựng được phương pháp định lượng chất oxostephanin và bước đầu xác định một số thông số phục vụ thiết lập chất này làm chất đối chiếu dùng trong kiểm nghiệm và nghiên cứu dược liệu củ dòm [12], [13], [14]. Một số phân đoạn và chất tinh khiết được chiết xuất và phân lập từ củ dòm có tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư [15], [16], [17], [18], tác dụng giải lo âu, an thần và chống trầm cảm [19], [20], [21], chống viêm giảm đau [22], [23], ức chế acetylcholinesterase [24].

Trong các hoạt chất đã được phân lập từ củ dòm, oxostephanin được tập  trung nghiên cứu nhiều hơn. Thử nghiệm in vitro cho thấy chất này có nhiều tácdụng sinh học đáng lưu ý, đặc biệt là tác dụng kháng tế bào ung thư [15]. Hàm lượng oxostephanin trong các mẫu thân lá cao hơn nhiều lần so với mẫu củ [13], [14]. Sử dụng thân lá có nhiều ưu điểm hơn so với sử dụng củ vì có thể thu hái được nhiều lần trong năm, đồng thời khi thu hái một phần thân lá, cây vẫn sống và tiếp tục2 phát triển. Ngược lại, theo kinh nghiệm dân gian thường chỉ thu hái củ khi cây từ 3 – 5 năm tuổi. Khi đó sẽ mất cả cây, thời gian nhân giống và phát triển cây mới cho đến khi thu hái kéo dài. Việc sử dụng thân lá thay cho củ đã được đồng bào dân tộc Dao, dân tộc Tày … ứng dụng trong thực tế, góp phần bảo tồn cây củ dòm; nâng cao năng suất thu hái, hiệu quả kinh tế. Tuy nhiên hiện vẫn chưa có nghiên cứu đánh giá về việc nên thu hái thân lá vào thời điểm nào trong năm để thu được hàm lượng hoạt chất cao mà vẫn đảm bảo phát triển cây thuốc này. Bên cạnh oxostephanin và một số ít các hợp chất đã được công bố, trong thân lá củ dòm còn các hợp chất nào khác, tác dụng sinh học và cơ chế tác dụng của các hợp chất này ra sao cũng chưa được nghiên cứu và làm rõ.
Tiếp nối kết quả của các nghiên cứu trước đây, để góp phần làm rõ thêm về thành phần hoá học có trong thân lá cây củ dòm và đánh giá tác dụng cũng nhưcơ chế tác dụng kháng ung thư của các hợp chất, đặc biệt là oxostephanin, luận án
“Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng kháng ung thư của thân lá cây củ dòm (Stephania dielsiana Y. C. Wu)” được tiến hành với các mục tiêu sau:
1. Chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc của một số hợp chất từ thân lá cây củ dòm.
2. Bước đầu xây dựng được phương pháp phân lập và phương pháp định lượng để theo dõi hàm lượng oxostephanin trong dược liệu theo thời gian thu hái.
3. Đánh giá được tác dụng gây độc tế bào của một số hợp chất đã phân lập và bước đầu nghiên cứu được cơ chế kháng ung thư của oxostephanin

MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………………………………………. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ………………………………………………………………………….. 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT ………………………………………………………………… 3
1.1.1. Vị trí phân loại ……………………………………………………………………………. 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật loài củ dòm ……………………………………………………… 3
1.1.3. Phân bố của loài củ dòm ………………………………………………………………. 4
1.2. THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÂY CỦ DÒM ………………………………………………. 6
1.2.1. Alcaloid ……………………………………………………………………………………… 6
1.2.2. Các nhóm hợp chất khác …………………………………………………………….. 11
1.3. TÁC DỤNG SINH HỌC, CÔNG DỤNG VÀ ĐỘC TÍNH CỦA CỦ DÒM ….. 13
1.3.1. Tác dụng sinh học………………………………………………………………………. 13
1.3.2. Độc tính của củ dòm…………………………………………………………………… 21
1.3.3. Công dụng ……………………………………………………………………………….. 22
1.4. MỤC TIÊU PHÂN TỬ TRONG PHÁT TRIỂN THUỐC ĐIỀU TRỊ UNG THƯ
……………………………………………………………………………………………………………………. 23
1.4.1. Tổng quan về một số mục tiêu phân tử trong nghiên cứu và phát triển thuốc
điều trị ung thư ………………………………………………………………………………….. 23
1.4.2. Aurora kinase và vai trò trong ung thư …………………………………………. 26
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………….. 37
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU …………………………………………………………………. 37
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ……………………………………………………………… 37
2.1.2. Một số dòng tế bào ung thư thí nghiệm ………………………………………… 37
2.1.3. Hóa chất, dung môi ……………………………………………………………………. 38
2.1.4. Máy móc, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu …………………………………….. 39
2.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU …………………………………………………………………….. 40
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ……………………………………………………………………. 41
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………………………………………………………. 41
2.4.1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ thân lá
cây củ dòm…………………………………………………………………………………………. 41
2.4.2. Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương pháp phân lập và phương pháp
định lượng để theo dõi hàm lượng oxostephanin trong dược liệu theo thời gian
thu hái ……………………………………………………………………………………………….. 44
2.4.3. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào của một số hợp chất đã phân lập và bước
đầu nghiên cứu cơ chế kháng ung thư của oxostephanin …………………………. 48vi
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU …………………………………………………….. 61
3.1. CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP
CHẤT TỪ THÂN LÁ CÂY CỦ DÒM …………………………………………………………… 61
3.1.1. Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ thân lá cây củ dòm…………….. 61
3.1.2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được……………… 62
3.2. BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ
PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỂ THEO DÕI HÀM LƯỢNG OXOSTEPHANIN
TRONG DƯỢC LIỆU THEO THỜI GIAN THU HÁI …………………………………….. 84
3.2.1. Phân lập và sơ bộ đánh giá độ tinh khiết của oxostephanin ……………… 84
3.2.2. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin trong thân
lá cây củ dòm……………………………………………………………………………………… 88
3.2.3. Đánh giá sự thay đổi hàm lượng oxostephanin theo thời gian thu hái . 98
3.3. ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT ĐÃ
PHÂN LẬP VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ KHÁNG UNG THƯ CỦA
OXOSTEPHANIN ………………………………………………………………………………………. 99
3.3.1. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào của một số hợp chất đã phân lập …. 99
3.3.2. Nghiên cứu cơ chế tác dụng gây độc tế bào của oxostephanin ………. 105
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN …………………………………………………………………………. 123
4.1. VỀ CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT
TỪ THÂN LÁ CÂY CỦ DÒM ……………………………………………………………………. 123
4.2. VỀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ
PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỂ THEO DÕI HÀM LƯỢNG OXOSTEPHANIN
TRONG DƯỢC LIỆU THEO THỜI GIAN THU HÁI …………………………………… 130
4.2.1. Về phân lập và sơ bộ đánh giá độ tinh khiết của oxostephanin ……….. 130
4.2.2. Về xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng ……………………. 133
4.2.3. Về sự thay đổi hàm lượng oxostephanin theo thời gian thu hái ……… 135
4.3. VỀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT
ĐÃ PHÂN LẬP VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ KHÁNG UNG THƯ CỦA
OXOSTEPHANIN …………………………………………………………………………………….. 138
4.3.1. Tác dụng gây độc tế bào của một số hợp chất đã phân lập ……………. 138
4.3.2. Cơ chế tác dụng gây độc tế bào của oxostephanin ……………………….. 142
4.4. VỀ ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN …………………………………………………. 146
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……………………………………………………………………. 148
DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số tác dụng khác của alcaloid trong củ dòm………………………………… 21
Bảng 1.2. Kết quả đánh giá độc tính cấp của củ dòm…………………………………………. 22
Bảng 1.3. Một số mục tiêu phân tử trong nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung
thư hiện nay và thuốc đại diện …………………………………………………………………… 26
Bảng 1.4. Sự biểu hiện quá mức hay khuếch đại gen Aurora kinase ở nhiều loại ung
thư khác nhau …………………………………………………………………………………………… 34
Bảng 1.5. Một số chất ức chế Aurora kinase ……………………………………………………. 36
Bảng 2.1. Dải nồng độ thử nghiệm của các hợp chất ………………………………………… 48
Bảng 2.2. Trình tự các mồi đặc hiệu được sử dụng cho RT‐qPCR ……………………… 56
Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR (δ ppm) của SD1 và chất tham khảo oxostephanin ……. 64
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR (δ ppm) của SD2 và chất tham khảo oxostephanin……. 67
Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR (δ ppm) của SD3 và hợp chất tham khảo…………………. 69
Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR (δ ppm) của SD4 và hợp chất tham khảo ………………… 70
Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR (δ ppm) của SD5 và hợp chất tham khảo…………………. 72
Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR (δ ppm) của SD6 và hợp chất tham khảo…………………. 73
Bảng 3.7. Số liệu phổ NMR (δ ppm) của SD7 và hợp chất tham khảo…………………. 75
Bảng 3.8. Số liệu phổ NMR (δ ppm) của SD8 và hợp chất tham khảo…………………. 77
Bảng 3.9. Số liệu phổ NMR (δ ppm) của SD9 và hợp chất tham khảo…………………. 78
Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR (δ ppm) của SD10 và hợp chất tham khảo……………… 79
Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR (δ ppm) của SD11 và hợp chất tham khảo …………….. 80
Bảng 3.12. Các hợp chất phân lập được từ thân lá cây củ dòm …………………………… 83
Bảng 3.13. Gradient nồng độ pha động C ……………………………………………………….. 87
Bảng 3.14. Tỷ lệ (%) diện tích pic của oxostephanin khi chạy HPLC bằng các pha
động khác nhau ………………………………………………………………………………………… 87
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát số lần chiết …………………………………………………………. 90
Bảng 3.16. Kết quả hàm lượng oxostephanin trong dược liệu thu được qua các lần
chiết ……………………………………………………………………………………………………….. 91
Bảng 3.17. Kết quả hàm lượng oxostephanin với lượng dung môi khác nhau ……….. 91
Bảng 3.18. Kết quả khảo sát thời gian chiết …………………………………………………….. 92
Bảng 3.19. Kết quả độ phù hợp hệ thống ………………………………………………………… 93
Bảng 3.20. Kết quả khảo sát độ tuyến tính ………………………………………………………. 94
Bảng 3.21. Kết quả độ lặp lại giữa các ngày phân tích ……………………………………… 95
Bảng 3.22. Kết quả độ thu hồi của oxostephanin ………………………………………………. 97
Bảng 3.23. Kết quả định lượng oxostephanin trong mẫu dược liệu thu hái tại Bắc
Giang ……………………………………………………………………………………………………… 98xii
Bảng 3.24. Đánh giá hàm lượng oxostephanin trong một số mẫu thân lá củ dòm thu
hái tại Quản Bạ – Hà Giang và vườn giống Ba Vì – Hà Nội …………………………… 99
Bảng 3.25. IC50 của các hợp chất trên các dòng tế bào ung thư trong thử nghiệm
MTS (μM) ……………………………………………………………………………………………… 104
Bảng 3.26. Giá trị IC50 của oxostephanin và VX-680 đối với tế bào ung thư OVCAR-
8 với thời gian ủ khác nhau ……………………………………………………………………… 10

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh của loài S. dielsiana Y. C. Wu………………………………………………. 4
Hình 1.2. Một số đặc điểm hình thái loài Stephania dielsiana Y. C. Wu ……………….. 5
Hình 1.3. Cấu trúc các alcaloid phân lập được từ loài củ dòm…………………………….. 10
Hình 1.4. Cấu trúc các alcaloid phân lập được từ loài củ dòm (tiếp) …………………… 11
Hình 1.5. Cấu trúc các hợp chất khác phân lập được từ loài củ dòm ……………………. 12
Hình 1.6. Tác dụng ức chế sự phát triển các dòng tế bào ung thư của phân đoạn chính
chiết từ củ dòm (SM2) – In vitro ………………………………………………………………… 13
Hình 1.7. Tác dụng ức chế sự phát triển các dòng tế bào ung thư của oxostephanin – In
vitro ……………………………………………………………………………………………………….. 15
Hình 1.8. Cấu trúc của Aurora kinase A, B và C ……………………………………………… 28
Hình 1.9. Sự phân bố của Aurora kinase A và B trong nguyên phân …………………… 29
Hình 1.10. Aurora kinase B điều hoà sự phân tách nhiễm sắc thể (A) và kiểm soát thoi
vô sắc (B) ……………………………………………………………………………………………….. 31
Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu ……………………………………………………………….. 42
Hình 2.2. Các dòng tế bào ung thư (a) MCF7, (b) HeLa, (c) OVCAR-8, (d) N87, (e)
HepG2 sau 48h nuôi cấy …………………………………………………………………………… 49
Hình 3.1. Tóm tắt quá trình chiết xuất, phân lập các hợp chất trong thân lá cây củ dòm
……………………………………………………………………………………………………………….. 63
Hình 3.2. A) Cấu trúc oxoaporphin; B) Cấu trúc của hợp chất SD1; C) Tương tác HMBC
chính của hợp chất SD1 …………………………………………………………………………….. 66
Hình 3.3. Cấu trúc và tương tác HMBC chính của hợp chất SD2………………………… 68
Hình 3.4. Cấu trúc của hợp chất SD3 ……………………………………………………………… 70
Hình 3.5. Cấu trúc của hợp chất SD4 ……………………………………………………………… 71
Hình 3.6. Cấu trúc của hợp chất SD5 ……………………………………………………………… 73
Hình 3.7. Cấu trúc và tương tác HMBC chính của hợp chất SD6………………………… 74
Hình 3.8. Cấu trúc của hợp chất SD7 ……………………………………………………………… 76
Hình 3.9. Cấu trúc của hợp chất SD8 ……………………………………………………………… 78
Hình 3.10. Cấu trúc của hợp chất SD9 ……………………………………………………………. 79
Hình 3.11. Cấu trúc của hợp chất SD10 ………………………………………………………….. 80
Hình 3.12. Cấu trúc của hợp chất SD11 ………………………………………………………….. 82
Hình 3.13. Quy trình phân lập oxostephanin ……………………………………………………. 86
Hình 3.14. Sắc ký đồ đánh giá độ tinh khiết của oxostephanin …………………………… 88
Hình 3.15. Phổ hấp thụ tử ngoại của oxostephanin ……………………………………………. 89
Hình 3.16. Sắc ký đồ dung dịch thử khi chạy pha động A (MeOH : acid formic 0,1%
(tỷ lệ 35:65, v/v)) ………………………………………………………………………………………. 90xiv
Hình 3.17. Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu……………………………………………………… 94
Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng
độ của oxostephanin ………………………………………………………………………………….. 95
Hình 3.19. Sắc ký đồ HPLC của oxostephanin ở nồng độ 0,002441 µg/ml …………… 97
Hình 3.20. Hình thái tế bào Hela……………………………………………………………………. 100
Hình 3.21. Hình thái tế bào HepG2………………………………………………………………… 100
Hình 3.22. Hình thái tế bào MCF7 …………………………………………………………………. 100
Hình 3.23. Hình thái tế bào N87…………………………………………………………………….. 100
Hình 3.24. Hình thái tế bào OVCAR-8 …………………………………………………………… 101
Hình 3.25. Hình thái các dòng tế bào thử nghiệm dưới tác dụng của SD1, SD2, SD3,
SD4 và SD5 tại thời điểm 48h (VK 10X, Zoom 5,6) ……………………………………. 103
Hình 3.26. Ảnh hưởng của oxostephanin và VX-680 theo thời gian thực lên tế bào
OVCAR-8 ……………………………………………………………………………………………… 106
Hình 3.27. Ảnh hưởng của oxostephanin và VX-680 lên thời gian nhân đôi của tế
bào OVCAR-8 ………………………………………………………………………………………… 108
Hình 3.28. Hình ảnh nhân tế bào sau khi ủ với oxostephanin và VX-680 trong 48
giờ …………………………………………………………………………………………………………. 108
Hình 3.29. Kích thước trung bình của vùng nhân tế bào sau khi ủ với oxostephanin
và VX-680 trong 48 giờ …………………………………………………………………………… 109
Hình 3.30. Oxostephanin gây ra quá trình apoptosis của tế bào OVCAR-8 ………… 110
Hình 3.31. Phân tích định lượng phần trăm apoptosis trong các tế bào được xử lý
bằng oxostephanin và VX-680 ………………………………………………………………….. 110
Hình 3.32. Khả năng hình thành và phát triển của khối u OVCAR-8 sau khi ủ với
oxostephanin và VX-680 ………………………………………………………………………….. 111
Hình 3.33. Ảnh hưởng của oxostephanin và VX-680 lên thể tích tương đối của khối
u…………………………………………………………………………………………………………….. 111
Hình 3.34. Hình thái của khối u được xử lý trong hai điều kiện …………………………. 112
Hình 3.35. Ảnh hưởng của oxostephanin và VX-680 lên quá trình phosphoryl hoá
của H3S10ph …………………………………………………………………………………………… 113
Hình 3.36. Ảnh hưởng của oxostephanin và VX-680 lên sự phân bố của Aurora
kinase B………………………………………………………………………………………………….. 114
Hình 3.37. Sự biểu hiện của Aurora A và Aurora B đã giảm ở mức mRNA sau khi
xử lý bằng oxostephanin và VX-680 ………………………………………………………….. 114
Hình 3.38. Ảnh hưởng của oxostephanin và VX-680 đến sự biểu hiện của Aurora
kinase B trong tế bào nguyên phân ……………………………………………………………. 115xv
Hình 3.39. Ảnh hưởng của oxostephanin lên biểu hiện mRNA của kinase Aurora A
và Aurora B trong các dòng tế bào ung thư và bình thường …………………………… 116
Hình 3.40. Khả năng sống sót của các tế bào UC-MSCs, hUVECs và hFBs được xử
lý với các nồng độ oxostephanin khác nhau sau 24, 48 và 72 giờ ủ ………………… 116
Hình 3.41. Đường cong ức chế tăng trưởng đáp ứng liều đối với oxostephanin của
ba loại tế bào …………………………………………………………………………………………… 117
Hình 3.42. Hình 3.42. Oxostephanin ảnh hưởng đến sự hình thành và hình thái khuẩn
lạc ở tế bào hUVECs và hFBs……………………………………………………………………. 117
Hình 3.43. Ảnh hưởng của oxostephanin lên số lượng khuẩn lạc được hình thành ở
tế bào hUVECs và hFBs …………………………………………………………………………… 118
Hình 3.44. Ảnh hưởng của oxostephanin lên sự bài tiết các yếu tố tăng trưởng ở tế
bào hUVECs và hFBs ………………………………………………………………………………. 119
Hình 3.45. Oxostephanin ức chế sự di chuyển của hUVECs và hFBs thể hiện qua
hình ảnh và độ che phủ vết thương (%) sau một thời gian di chuyển của tế bào.. 120
Hình 3.46. Ảnh hưởng của oxostephanin đến sự hình thành mạch của hUVECs….. 120
Hình 3.47. Định lượng sự hình thành mạch khi cấy hUVECs trên Matrigel với sự có
mặt của oxostephanin ………………………………………………………………………………. 121
Hình 3.48. Khả năng ức chế hình thành mạch của oxostephanin trên hUVECs so với
đối chứng (%) …………………………………………………………………………………………. 122
Hình 4.1. Hình ảnh cây củ dòm qua một số thời điểm ……………………………………….13