Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng ung thư in vitro của loài Nghệ đắng (Curcuma zedoaroides Chaveer. & Tanee), họ Gừng (Zingiberaceae)

Luận án tiến sĩ dược học Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng ung thư in vitro của loài Nghệ đắng (Curcuma zedoaroides Chaveer. & Tanee), họ Gừng (Zingiberaceae). Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hiện nay có 65% dân số thế giới trong đó có 80% dân số ở các nước đang phát triển dựa vào y học cổ truyền để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe, trong đó chủ yếu là sử dụng thuốc từ cây cỏ. Ngành công nghiệp dược liệu đóng góp khoảng 100 tỉ USD và có tiềm năng tăng trưởng tốt trên toàn cầu. WHO báo cáo rằng việc kinh doanh dược liệu và thuốc từ dược liệu tăng trưởng với tỉ lệ 15% mỗi năm [1]. Cây thuốc đóng vai trò quan trọng trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới, gần 25% thuốc trên thị trường hiện nay có nguồn gốc từ thực vật. Nhiều thuốc khác được bán tổng hợp = từ các hoạt chất phân lập từ thực vật. Đến nay, WHO đã công nhận dược liệu là thành phần quan trọng trong chăm sóc sức khỏe ban đầu [1]. Ước tính trên thế giới có khoảng 500000 loài thực vật, trong đó chỉ có khoảng 6% loài được nghiên cứu hoạt tính và khoảng 15% loài được nghiên cứu thành phần hóa học [2]. Do đó, cần thiết phải triển khai các nghiên cứu để tạo cơ sở dữ liệu khoa học về cây cỏ làm thuốc, góp phần đảm bảo sử dụng cây cỏ làm thuốc một cách an toàn và hiệu quả.

Hiện nay, một trong những thách thức lớn nhất mà y học hiện đại đang phải đối mặt là ung thư. Đây là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Theo Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) thuộc WHO, có khoảng 20 triệu ca ung thư được chẩn đoán vào năm 2022, tăng từ 18 triệu ca năm 2020. Các loại ung thư phổ biến nhất năm 2022 là ung thư phổi (2,5 triệu ca mắc mới), ung thư vú (2,3 triệu), ung thư đại trực tràng (1,9 triệu), ung thư tuyến tiền liệt (1,5 triệu) và ung thư dạ dày (9,7 triệu). Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc ung thư năm 2022 thuộc top đầu thế giới với 180480 ca mắc mới và 409144 ca hiện mắc. Các loại ung thư phổ biến nhất là vú, gan, phổi, đại trực tràng và dạ dày. Đối với nam giới, ung thư gan, phổi, dạ dày, đại trực tràng và tiền liệt tuyến chiếm khoảng 64,3% tổng các loại ung thư. Ở nữ giới, ung thư vú, phổi, đại trực tràng, dạ dày và gan chiếm khoảng 60,1% tổng các loại ung thư [3]. Với sự phát triển của khoa
học và công nghệ, các phương pháp điều trị ung thư ngày càng cải tiến và hiện đại hơn. Việc tìm kiếm và phát triển các thuốc mới có nguồn gốc từ thảo dược là một trong những xu thế của ngành Công nghiệp Dược hiện nay. Theo Newman D. J. và cộng sự, từ năm 1981 đến năm 2019, khoảng 25% tổng số thuốc chống ung thư mới được phê duyệt có liên quan đến các sản phẩm tự nhiên [4].
Một trong số dược liệu đã được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính là Nghệ đắng (Curcuma zedoaroides Chaveer. & Tanee, Zingiberaceae). Loài này đã được mô tả lần đầu tiên vào năm 2008 bởi các nhà Thực vật người Thái Lan và có tên địa phương là Wan-Paya-Ngoo-Tua-Mia, thường được sử dụng ở vùng đông bắc Thái Lan như một loại ‘thuốc giải độc rắn cắn’ [5], [6] và chăm sóc vết thương [6]. Nhóm nghiên cứu đã phát hiện Nghệ đắng ở Việt Nam năm 2017 tại xã Minh Lập, huyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên [7]. Mặc dù các nghiên cứu về loài này vẫn còn hạn chế. Tuy nhiên, một số loài thuộc chi Curcuma L. đã được nghiên cứu và sử dụng làm thuốc từ lâu đời [8]. Các loài Curcuma này cũng đã được báo cáo về hoạt tính kháng ung thư tiềm năng (chống tăng sinh, gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis), tự thực bào,…) [9]. Do đó, đề tài Nghị định thư Việt – Hàn “Nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư và điều hòa miễn dịch của một số cây thuốc Việt Nam”, mã số NĐT.85.KR/20, đã lựa chọn Nghệ đắng là một trong số 24 loài được đưa vào sàng lọc hoạt tính kháng ung thư và điều hòa miễn dịch in vitro. Kết quả sàng lọc sơ bộ trên 2 dòng tế bào A549 và MCF-7 cho thấy cao toàn phần ethanol 70% của thân rễ Nghệ đắng ở nồng độ 20 µg/mL (với thời gian ủ mẫu 24 giờ) thể hiện khả năng ức chế sự sống sót của hai dòng tế bào này (tương ứng là 35,04 và 39,42%) [10]. Vì vậy, để cung cấp cơ sở khoa học góp phần nâng cao giá trị của loài Nghệ đắng, luận án “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng ung thư in vitro của loài Nghệ đắng (Curcuma zedoaroides Chaveer. & Tanee), họ Gừng (Zingiberaceae)” đã được thực hiện với các mục tiêu:
1. Xác định được thành phần, hàm lượng của tinh dầu và một số thành phần trong cao chiết có hoạt tính kháng ung thư in vitro của loài Nghệ đắng.
2. Sàng lọc được hoạt tính gây độc trên một số dòng tế bào ung thư in vitro của tinh dầu, cao chiết, chất phân lập để từ đó đánh giá ảnh hưởng của chất tiềm năng trên biểu hiện một số protein liên quan
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………………………………………….1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ………………………………………………………………………………3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHI CURCUMA L………………………………………………………..3
1.1.1. Thực vật học của chi Curcuma L………………………………………………………….3
1.1.2. Thành phần hóa học của chi Curcuma L. ………………………………………………4
1.1.3. Tác dụng sinh học của chi Curcuma L. ……………………………………………….15
1.1.4. Phân bố và công dụng của một số loài thuộc chi Curcuma L………………….27
1.2. TỔNG QUAN VỀ LOÀI NGHỆ ĐẮNG (C. zedoaroides) ………………………….29
1.2.1. Đặc điểm thực vật của loài Nghệ đắng ………………………………………………..29
1.2.2. Sinh thái và phân bố của loài Nghệ đắng……………………………………………..29
1.2.3. Thành phần hóa học của loài Nghệ đắng ……………………………………………..29
1.2.4. Tác dụng sinh học của loài Nghệ đắng ………………………………………………..30
1.2.5. Công dụng của loài Nghệ đắng …………………………………………………………..30
1.3. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ …………………………………………………………………31
1.3.1. Khái niệm ………………………………………………………………………………………..31
1.3.2. Phân loại………………………………………………………………………………………….31
1.3.3. Cơ chế ung thư …………………………………………………………………………………32
1.3.4. Một số protein tham gia vào các con đường liên quan đến ung thư …………36
1.3.5. Một số phương pháp đánh giá khả năng sống sót của tế bào ung thư ………40
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………………44
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ………………………………………………………………….44
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu …………………………………………………………………….44
2.1.2. Thuốc thử, hóa chất, dung môi và dòng tế bào ……………………………………..45
2.1.3. Dụng cụ, máy móc và thiết bị nghiên cứu ……………………………………………47
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU…………………………………………………………………….49
2.2.1. Nội dung nghiên cứu về thành phần hoá học………………………………………..49
2.2.2. Nội dung nghiên cứu về hoạt tính kháng ung thư………………………………….49
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………………………………………………………….50
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học ………………………………………50
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư ………………………………..55
2.3.3. Xử lý số liệu …………………………………………………………………………………….62
2.4. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ……………………………………………………………………..62
2.4.1. Địa điểm nghiên cứu thành phần hóa học…………………………………………….62
2.4.2. Địa điểm nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư………………………………………63
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU …………………………………………………………..64
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT
TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ IN VITRO CỦA TINH DẦU …………………64
3.1.1. Kết quả xác định hàm lượng và thành phần hóa học của tinh dầu …………..64
3.1.2. Kết quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của tinh dầu…..69
3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG
KHÁNG UNG THƯ IN VITRO CỦA CAO CHIẾT………………………………………….69
3.2.1. Kết quả chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn của cao toàn phần 69
3.2.2. Kết quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của cao chiết….71
3.2.3. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất ………………………..74
3.2.4. Kết quả xác định các thành phần bay hơi trong cao chiết bằng GC-MS …101
3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ IN VITRO VÀ IN
SILICO CỦA CÁC HỢP CHẤT …………………………………………………………………..104
3.3.1. Kết quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất
………………………………………………………………………………………………………………104
3.3.2. Kết quả nghiên cứu trên biểu hiện một số protein của các hợp chất tiềm năng
………………………………………………………………………………………………………………106
3.3.3. Kết quả mô phỏng tương tác phân tử nghiên cứu mối tương quan cấu trúc và
hoạt tính kháng ung thư của hợp chất tiềm năng ………………………………………….108
3.4. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT …………………………..111
3.4.1. Kết quả nghiên cứu định lượng đồng thời (1R,4S,5S,10R)-zedoarondiol và
curdion trong dược liệu Nghệ đắng bằng HPLC-DAD …………………………………112
3.4.2. Ứng dụng phương pháp định lượng (1R,4S,5S,10R)-zedoarondiol và curdion
trên mẫu dược liệu Nghệ đắng …………………………………………………………………..119
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ……………………………………………………………………………..121
4.1. VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU…………………………………………………………..121
4.2. VỀ KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC …………………………..123
4.2.1. Về thành phần hóa học của tinh dầu ………………………………………………….123
4.2.2. Về kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất …..126
4.2.3. Về kết quả phân tích thành phần bay hơi trong cao chiết bằng GC-MS….131
4.2.4. Về kết quả định lượng……………………………………………………………………..132
4.3. VỀ KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ…………………133
4.3.1. Về kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của tinh dầu
………………………………………………………………………………………………………………133
4.3.2. Về kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của cao chiết
và chất tinh khiết ……………………………………………………………………………………..138
4.3.3. Về kết quả nghiên cứu trên một số đích phân tử của các chất tiềm năng ..142
4.3.4. Về kết quả mô phỏng tương tác phân tử nghiên cứu mối tương quan cấu trúc
và hoạt tính kháng ung thư của hợp chất tiềm năng ……………………………………..142
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………………………………………145
KẾT LUẬN………………………………………………………………………………………………..145
KIẾN NGHỊ……………………………………………………………………………………………….146
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ…………………………………………..147
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

 DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Danh sách một số loài Curcuma nghiên cứu về thành phần hóa học ………….4
Bảng 1.2. Phân bố và công dụng các loài thuộc chi Curcuma L……………………………..28
Bảng 3.1. Hàm lượng tinh dầu từ các bộ phận của Nghệ đắng ……………………………….64
Bảng 3.2. Thành phần hóa học của tinh dầu từ các bộ phận của Nghệ đắng …………….65
Bảng 3.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của tinh dầu Nghệ đắng …………..69
Bảng 3.4. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các cao chiết từ thân rễ Nghệ
đắng ……………………………………………………………………………………………………………….72
Bảng 3.5. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các cao chiết từ phần trên mặt
đất Nghệ đắng………………………………………………………………………………………………….73
Bảng 3.6. Dữ liệu phổ của hợp chất R1 và chất tham khảo ……………………………………76
Bảng 3.7. So sánh dữ liệu phổ của hợp chất R1-R3 ……………………………………………..79
Bảng 3.8. Dữ liệu phổ của hợp chất R2 và chất tham khảo ……………………………………80
Bảng 3.9. Dữ liệu phổ của hợp chất R3 và chất tham khảo ……………………………………81
Bảng 3.10. Dữ liệu phổ của hợp chất R4 và chất tham khảo ………………………………….83
Bảng 3.11. Dữ liệu phổ của hợp chất R5 và chất tham khảo ………………………………….84
Bảng 3.12. Dữ liệu phổ của hợp chất R6 và chất tham khảo ………………………………….86
Bảng 3.13. Dữ liệu phổ của hợp chất R7 và chất tham khảo ………………………………….87
Bảng 3.14. Dữ liệu phổ của hợp chất R8 và chất tham khảo ………………………………….88
Bảng 3.15. Dữ liệu phổ của hợp chất R9 và chất tham khảo ………………………………….90
Bảng 3.16. Dữ liệu phổ của hợp chất R10 và chất tham khảo ………………………………..91
Bảng 3.17. Dữ liệu phổ của hợp chất R11 và chất tham khảo ………………………………..93
Bảng 3.18. Dữ liệu phổ của hợp chất R12 và chất tham khảo ………………………………..95
Bảng 3.19. Dữ liệu phổ của hợp chất AP1 và chất tham khảo………………………………..98
Bảng 3.20. Dữ liệu phổ của hợp chất AP2 và chất tham khảo………………………………100
Bảng 3.21. Các thành phần dễ bay hơi có trong cao cao chiết RH và APH……………102
Bảng 3.22. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất phân lập từ thân
rễ Nghệ đắng………………………………………………………………………………………………….105
Bảng 3.23. Kết quả docking của aerugidiol (R8) với thụ thể EGFR và HER2 ……….109
Bảng 3.24. Thông số pic của các chất định phân ………………………………………………..114
Bảng 3.25. Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất…………….114
Bảng 3.26. Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống…………………………………….116
Bảng 3.27. LOD và LOQ của (1R,4S,5S,10R)-zedoarondiol và curdion………………..116
Bảng 3.28. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp…………………………………….117
Bảng 3.29. Độ thu hồi dược liệu Nghệ đắng ………………………………………………………118
Bảng 3.30. Kết quả hàm lượng (1R,4S,5S,10R)-zedoarondiol và curdion trong mẫu Nghệ
đắng ……………………………………………………………………………………………………………..120
Bảng 4.1. So sánh đặc điểm thực vật giữa loài C. zedoaroides và C. zedoaria……….121
Bảng 4.2. Danh sách các chất phân lập từ Nghệ đắng …………………………………………127
Bảng 4.3. Sự phân bố của các hợp chất từ Nghệ đắng trong chi Curcuma L. …………129
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Một số hợp chất monoterpenoid từ chi Curcuma L. …………………………………5
Hình 1.2. Một số hợp chất sesquiterpenoid từ chi Curcuma L. ………………………………..8
Hình 1.3. Một số hợp chất diterpenoid từ chi Curcuma L. ………………………………………8
Hình 1.4. Một số hợp chất sesterterpenoid và triterpenoid từ chi Curcuma L…………….9
Hình 1.5. Một số hợp chất diphenylheptanoid từ chi Curcuma L……………………………10
Hình 1.6. Một số hợp chất diphenylpentanoid từ chi Curcuma L……………………………10
Hình 1.7. Một số hợp chất diphenylalkanoid khác trong chi Curcuma L…………………11
Hình 1.8. Một số dẫn xuất phenylpropen từ chi Curcuma L…………………………………..11
Hình 1.9. Một số hợp chất flavonoid từ chi Curcuma L. ……………………………………….12
Hình 1.10. Một số hợp chất steroid từ chi Curcuma L…………………………………………..12
Hình 1.11. Một số hợp chất alkaloid từ chi Curcuma L…………………………………………13
Hình 1.12. Một số hợp chất khác từ chi Curcuma L. …………………………………………….14
Hình 1.13. Cấu trúc của các hợp chất phân lập từ Nghệ đắng ………………………………..30
Hình 2.1. Nghệ đắng (Curcuma zedoaroides Chaveer. & Tanee) …………………………..44
Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu ……………………………………………………………………50
Hình 2.3. Phản ứng nhuộm màu tế bào sống bằng phương pháp MTT ……………………55
Hình 2.4. Phản ứng nhuộm màu tế bào sống bằng phương pháp SRB …………………….56
Hình 3.1. Tóm tắt quá trình chiết xuất cao từ thân rễ Nghệ đắng ……………………………70
Hình 3.2. Tóm tắt quá trình chiết xuất cao từ phần trên mặt đất Nghệ đắng …………….71
Hình 3.3. Tóm tắt quá trình phân lập các hợp chất từ cao RH………………………………..74
Hình 3.4. Tóm tắt quá trình phân lập các hợp chất từ cao RE………………………………..75
Hình 3.5. Cấu trúc hóa học (A) và các tương tác HMBC (B) và NOESY (C) chính của
hợp chất R1……………………………………………………………………………………………………..77
Hình 3.6. Cấu trúc hóa học (A) và các tương tác HMBC (B) và NOESY (C) chính của
hợp chất R2……………………………………………………………………………………………………..78
Hình 3.7. Cấu trúc hóa học (A) và các tương tác HMBC (B) và NOESY (C) chính của
hợp chất R3……………………………………………………………………………………………………..82
Hình 3.8. Cấu trúc hóa học (A) và các tương tác HMBC (B) và NOESY (C) chính của
hợp chất R4……………………………………………………………………………………………………..83
Hình 3.9. Cấu trúc hóa học (A) và các tương tác HMBC (B) chính của hợp chất R5..85
Hình 3.10. Cấu trúc hóa học (A) và các tương tác HMBC (B) và NOESY (C) chính của
hợp chất R6……………………………………………………………………………………………………..86
Hình 3.11. Cấu trúc hóa học (A) và các tương tác HMBC (B) chính của hợp chất R788
Hình 3.12. Cấu trúc hóa học (A) và các tương tác HMBC (B) chính của hợp chất R8 và
hợp chất 1-epi-aerugidiol (C) …………………………………………………………………………….89
Hình 3.13. Cấu trúc hóa học (A) và các tương tác HMBC (B) và NOESY (C) chính của
hợp chất R9……………………………………………………………………………………………………..91
Hình 3.14. Cấu trúc hóa học (A) và các tương tác HMBC (B) và NOESY (C) chính của
hợp chất R10……………………………………………………………………………………………………92
Hình 3.15. Cấu trúc hóa học (A) và các tương tác HMBC (B) và NOESY (C) chính của
hợp chất R11……………………………………………………………………………………………………94
Hình 3.16. Cấu trúc hóa học (A) và các tương tác HMBC (B) và NOESY (C) chính của
hợp chất R12……………………………………………………………………………………………………96
Hình 3.17. Tóm tắt quá trình phân lập các hợp chất từ cao APH ……………………………97
Hình 3.18. Cấu trúc hóa học (A) và các tương tác COSY và HMBC chính (B) của hợp
chất AP1 …………………………………………………………………………………………………………99
Hình 3.19. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP2 ………………………………………………….101
Hình 3.20. Ảnh hưởng của các hợp chất tinh khiết trên biểu hiệu của protein p53 trong
dòng tế bào A549……………………………………………………………………………………………106
Hình 3.21. Ảnh hưởng của hợp chất aerugidiol (R8) trên biểu hiệu của các protein trong
dòng tế bào A549 theo nồng độ (0,3 – 1 μM)……………………………………………………..107
Hình 3.22. Kết quả mô phỏng tương tác phân tử của các phối tử đồng kết tinh………108
Hình 3.23. Cấu trúc hình học 3D tối ưu của aerugidiol (R8)………………………………..109
Hình 3.24. Sự tương tác 2D và 3D của aerugidiol (R8) trên vị trí hoạt động của protein
EGFR và HER2 ……………………………………………………………………………………………..111
Hình 3.25. Phổ UV của (1R,4S,5S,10R)-zedoarondiol và curdion…………………………112
Hình 3.26. Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc của phương pháp …………………………….113
Hình 3.27. So sánh phổ của các chất định phân trong mẫu thử dược liệu Nghệ đắng và
trong mẫu chuẩn …………………………………………………………………………………………….113
Hình 3.28. Các đường chuẩn định lượng (1R,4S,5S,10R)-zedoarondiol và curdion…115
Hình 3.29. Sắc ký đồ HPLC-DAD phân tích mẫu Nghệ đắng………………………………119
Hình 4.1. Các thành phần chính trong tinh dầu Nghệ đắng ………………………………….125
Hình 4.2. Các hợp chất phân lập từ Nghệ đắng (R1-R12, AP1 và AP2) ……………….12