Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Thiên niên kiện lá lớn

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Thiên niên kiện lá lớn. Hiện nay, xu hướng nghiên cứu phát triển thuốc từ các loại dược liệu thông qua việc tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học ngày càng được các nhà khoa học quan tâm. Trong xu thế đó, Việt Nam có một kho tàng tài nguyên cây thuốc với hơn 5.000 loài cần được nghiên cứu và khám phá1.
Chi Thiên niên kiện (Homalomena) là một chi lớn của họ Ráy (araceae), có khoảng gần 200 loài, phân bố chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á, Nam Thái Bình Dương và Nam Mỹ2. Một số loài Homalomena đã được sử dụng trong y học cổ truyền và y học dân tộc của nhiều nước, đặc biệt là các nước châu Á để điều trị vết thương, tiêu chảy, ho, đau bụng, rối loạn dạ dày và hệ thần kinh trung ương3. Ở Việt Nam, từ lâu người dân đã biết dùng rễ loài Thiên niên kiện (Homalomena occulta) để điều trị đau dạ dày, viêm khớp dạng thấp, cũng như làm thuốc chống viêm và thuốc bổ4. Các hợp chất phân lập từ chi Homalomena cũng đã được báo cáo sở hữu nhiều hoạt tính sinh học tiềm năng như oplodiol được phân lập từ H. occulta có tác dụng gây độc tế bào ung thư biểu mô tuyến phổi người A5495, homalomenol C phân lập từ rễ loài H. aromatica6, có hoạt tính kháng sốt rét Plasmodium falciparum kháng chloroquin7… Như vậy, với số lượng loài phong phú, chi Homalomena có tiềm năng to lớn cho nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất mới có tác dụng chữa bệnh.

Ở Việt Nam, 5 loài Homalomena đã được ghi nhận, phân bố chủ yếu ở nơi ẩm, dưới tán rừng, ven suối 4,8. Tuy nhiên, hiện nay các công bố về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của chi này còn rất hạn chế, chủ yếu tập trung vào loài H. occulta. Như vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thuộc chi Homalomena ở Việt Nam là bước khởi đầu cần thiết để tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có giá trị, góp phần khai thác và sử dụng nguồn tài nguyên cây thuốc trong nước. Thiên niên kiện lá lớn (H. pendula) là loài cây đã được sử dụng trong dân gian để điều trị viêm nhiễm và đau nhức xương khớp1. Tuy nhiên hiện tại ở Việt Nam các nghiên cứu khoa học chứng minh cho các tác dụng này còn rất hạn chế. Để góp phần giải thích, chứng minh tác dụng của dược liệu Thiên niên kiện lá lớn, cũng như cung cấp cơ sở dữ liệu về hóa học và dược lý, làm căn cứ khoa2 học cho việc khai thác, sử dụng và phát triển loài này, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Thiên niên kiện lá lớn (Homalomena pendula (Blume) Bakh.f.)” được thực hiện với 2 mục tiêu:
1. Nghiên cứu về thành phần hóa học: Xác định được hàm lượng và các thành phần chính của tinh dầu; chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất từ thân rễ cây Thiên niên kiện lá lớn.
2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học: Đánh giá hoạt tính kháng viêm, độc tế bào ung thư, ức chế acetylcholinesterase của cao chiết toàn phần, cao chiết phân đoạn, tinh dầu và các hợp chất phân lập được từ thân rễ cây Thiên niên kiện lá lớn

MỤC LỤC
Trang
LỜI CÁM ƠN ………………………………………………………………………………………………i
LỜI CAM ĐOAN…………………………………………………………………………………………ii
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH – VIỆT….iv
DANH MỤC CÁC BẢNG…………………………………………………………………………..vii
DANH MỤC CÁC HÌNH…………………………………………………………………………….ix
ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………………………………………1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………………………….3
1.1. Tổng quan về chi Homalomena Schott……………………………………………….3
1.2. Tổng quan về loài Homalomena pendula (Blume) Bakh.f…………………..30
1.3. Khái niệm về viêm và các mô hình đánh giá tác dụng chống viêm in vitro
……………………………………………………………………………………………………………33
1.4. Một số phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro……………38
1.5. Một số phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế acetylcholinesterase in
vitro …………………………………………………………………………………………………….39
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………………..42
2.1. Quy trình nghiên cứu ……………………………………………………………………..42
2.2. Đối tượng nghiên cứu …………………………………………………………………….43
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ……………………………………………………46
2.4. Phương pháp nghiên cứu ………………………………………………………………..47
2.5. Phương pháp phân tích số liệu…………………………………………………………59
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………………………………………………60
3.1. Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học ……………………………………….60
3.2. Kết quả nghiên cứu hoạt tính sinh học…………………………………………….118
Chương 4. BÀN LUẬN …………………………………………………………………………….130
4.1. Về thành phần hóa học………………………………………………………………….130
4.2. Về hoạt tính sinh học ……………………………………………………………………144
4.3. Về những đóng góp mới của đề tài…………………………………………………153
4.4. Một số hạn chế của đề tài………………………………………………………………154
KẾT LUẬN ……………………………………………………………………………………………..155
KIẾN NGHỊ …………………………………………………………………………………………….157
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN …………………….
TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………………………………
PHỤ LỤC …………………………………………………………………………………………………….

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Khoá định loài các loài thuộc chi Homalomena ở Việt Nam…………………4
Bảng 1.2. So sánh đặc điểm vi phẫu rễ của một số loài Homalomena…………………..5
Bảng 1.3. Một số loài thuộc chi Homalomena ở Việt Nam …………………………………6
Bảng 1.4. Thành phần hoá học chính của tinh dầu một số loài chi Homalomena……8
Bảng 1.5. Các sesquiterpenoid phân lập từ chi Homalomena …………………………….10
Bảng 1.6. Một số hợp chất phân lập từ chi Homalomena ………………………………….16
Bảng 1.7. Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu và dịch chiết các loài Homalomena25
Bảng 1.8. Hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ loài H. occulta.26
Bảng 2.1. Danh mục dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu……………………44
Bảng 2.2. Dung mục các trang thiết bị, dụng cụ dùng trong nghiên cứu ……………..45
Bảng 2.3. Danh mục các phần mềm/ chương trình sử dụng trong nghiên cứu ……..46
Bảng 2.4. Thành phần của hỗn hợp phản ứng đánh giá hoạt tính ức chế AChE……….57
Bảng 3.1. Kết quả độ tinh khiết của bột thân rễ Thiên niên kiện lá lớn ……………….60
Bảng 3.2. Hàm lượng tinh dầu thân rễ Thiên niên kiện lá lớn ……………………………60
Bảng 3.3. Thành phần hóa học của tinh dầu thân rễ Thiên niên kiện lá lớn …………60
Bảng 3.4. Độ ẩm các cao chiết xuất từ thân rễ Thiên niên kiện lá lớn…………………63
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của các cao chiết lên khả năng sống sót của tế bào RAW 264.7
………………………………………………………………………………………………………………….64
Bảng 3.6. Kết quả ức chế sản sinh NO của các cao chiết…………………………………..64
Bảng 3.7. Số liệu phổ NMR của Occultapenoid và hợp chất 1 …………………………..70
Bảng 3.8. Số liệu phổ NMR của Teucladiol và hợp chất 2 ………………………………..73
Bảng 3.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất 3 …………………………………………………….75
Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của Teuclatriol, epi- Teuclatriol và hợp chất 4 ………79
Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất 5 và chất tham khảo………………………..81
Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất 6 và chất tham khảo………………………..82
Bảng 3.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất 7 và chất tham khảo………………………..83
Bảng 3.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất 8 và chất tham khảo………………………..85
Bảng 3.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất 9 và chất tham khảo………………………..86
Bảng 3.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất 10 và chất tham khảo………………………87
Bảng 3.17. Số liệu phổ NMR của hợp chất 11 và chất tham khảo………………………89
Bảng 3.18. Số liệu phổ NMR của hợp chất 12 và chất tham khảo………………………91
Bảng 3.19. Số liệu phổ NMR của hợp chất 13 và chất tham khảo………………………92
Bảng 3.20. Số liệu phổ NMR của hợp chất 14 và chất tham khảo………………………93viii
Bảng 3.21. Số liệu phổ NMR của hợp chất 15 và chất tham khảo………………………94
Bảng 3.22. Số liệu phổ NMR của hợp chất 16 và chất tham khảo………………………95
Bảng 3.23. Số liệu phổ NMR của hợp chất 17 và chất tham khảo………………………96
Bảng 3.24. Số liệu phổ NMR của hợp chất 18 và chất tham khảo………………………98
Bảng 3.25. Số liệu phổ NMR của hợp chất 19 …………………………………………………99
Bảng 3.26. Số liệu phổ NMR của hợp chất 20 và chất tham khảo…………………….102
Bảng 3.27. Số liệu phổ NMR của hợp chất 21 và chất tham khảo…………………….103
Bảng 3.28. Số liệu phổ NMR của hợp chất 22 và chất tham khảo…………………….104
Bảng 3.29. Số liệu phổ NMR của hợp chất 23 và chất tham khảo…………………….106
Bảng 3.30. Số liệu phổ NMR của hợp chất 24 và chất tham khảo…………………….107
Bảng 3.31. Số liệu phổ NMR của hợp chất 25 và chất tham khảo…………………….109
Bảng 3.32. Số liệu phổ NMR của hợp chất 26 và chất tham khảo…………………….110
Bảng 3.33. Số liệu phổ NMR của hợp chất 27 và chất tham khảo…………………….112
Bảng 3.34. Số liệu phổ NMR của hợp chất 28 và chất tham khảo…………………….113
Bảng 3.35. Các chất phân lập được từ thân rễ Thiên niên kiện lá lớn………………..114
Bảng 3.36. Ảnh hưởng của các hợp chất tinh khiết và tinh dầu lên khả năng sống sót
của tế bào RAW 264.7………………………………………………………………………………..118
Bảng 3.37. Kết quả ức chế sản sinh NO của các hợp chất và tinh dầu……………….119
Bảng 3.38. Ảnh hưởng của chất 1 và chất 14 lên khả năng sống sót của tế bào ….120
Bảng 3.39. Ảnh hưởng của hợp chất 1 và hợp chất 14 đến mức độ sản sinh IL-6, TNF-
α , IL-10, và PGE2 ……………………………………………………………………………………..121
Bảng 3.40. Kết quả ức chế tế bào SK-LU-1 của các cao chiết và tinh dầu Thiên niên
kiện lá lớn ở nồng độ 100 µg/ml ………………………………………………………………….123
Bảng 3.41. Kết quả ức chế tế bào ung thư phổi SK-LU-1 của các chất tinh khiết ở
nồng độ 100 µM ………………………………………………………………………………………..123
Bảng 3.42. Kết quả ức chế một số dòng tế bào ung thư của hợp chất 23 và 26…..124
Bảng 3.43. Kết quả ức chế acetylcholinesterase của các cao chiết và tinh dầu……125
Bảng 3.44. Kết quả ức chế acetylcholinesterase của cao n-hexan và tinh dầu Thiên
niên kiện lá lớn ………………………………………………………………………………………….126
Bảng 3.45. Kết quả ức chế acetylcholinesterase của các chất phân lập được từ thân rễ
Thiên niên kiện lá lớn ở nồng độ 10 µM ……………………………………………………….126
Bảng 3.46. Kết quả ức chế acetylcholinesterase in vitro của Teucmosin……………127ix
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Homalomena ở Việt Nam…………………….7
Hình 1.2. Cấu trúc của một số hợp chất chiếm hàm lượng cao trong tinh dầu chi
Homalomena…………………………………………………………………………………………………9
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của các hợp chất sesquiterpenoid khung isodaucan phân
lập từ chi Homalomena…………………………………………………………………………………12
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của các sesquiterpenoid khung oplopanan phân lập từ chi
Homalomena……………………………………………………………………………………………….12
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của các hợp chất sesquiterpenoid khung eudesman phân
lập từ chi Homalomena…………………………………………………………………………………13
Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của các hợp chất sesquiterpenoid khung aromadendran
phân lập từ chi Homalomena…………………………………………………………………………13
Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của các hợp chất sesquiterpenoid khung oppositan phân
lập từ chi Homalomena…………………………………………………………………………………14
Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của các hợp chất sesquiterpenoid khung guaian phân lập
từ chi Homalomena ……………………………………………………………………………………..14
Hình 1.9. Cấu trúc hóa học của các sesquiterpenoid khung cadinan phân lập từ chi
Homalomena……………………………………………………………………………………………….14
Hình 1.10. Cấu trúc hoá học của các sesquiterpenoid khác phân lập từ chi
Homalomena……………………………………………………………………………………………….15
Hình 1.11. Cấu trúc của một số khung sesquiterpenoid phổ biến trong chi
Homalomena……………………………………………………………………………………………….15
Hình 1.12. Cấu trúc của hợp chất alcaloid phân lập trong chi Homalomena ………..17
Hình 1.13. Cấu trúc của các hợp chất diterpenoid phân lập trong chi Homalomena17
Hình 1.14. Cấu trúc của các hợp chất dẫn xuất steroid phân lập trong chi Homalomena
………………………………………………………………………………………………………………….18
Hình 1.15. Cấu trúc của các hợp chất cerebrosid phân lập trong chi Homalomena.18
Hình 1.16. Cấu trúc của các hợp chất lignan phân lập trong chi Homalomena …….18
Hình 1.17. Cấu trúc của các hợp chất lipid phân lập trong chi Homalomena ……….19
Hình 1.18. Cấu trúc của các hợp chất dẫn xuất acid benzoic phân lập trong chi
Homalomena……………………………………………………………………………………………….19
Hình 1.19. Cấu trúc của các hợp chất khác phân lập từ chi Homalomena……………20
Hình 1.20. Hình ảnh cây Thiên niên kiện lá lớn……………………………………………….31
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nghiên cứu …………………………………………………………….42x
Hình 2.2. Cây Thiên niên kiện lá lớn………………………………………………………………43
Hình 3.1. Quy trình chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn từ thân rễ Thiên niên
kiện lá lớn …………………………………………………………………………………………………..63
Hình 3.2. Quy trình phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao phân đoạn n-hexan của
thân rễ Thiên niên kiện lá lớn ………………………………………………………………………..68
Hình 3.3. Quy trình phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao phân đoạn ethyl acetat
của thân rễ Thiên niên kiện lá lớn ………………………………………………………………….69
Hình 3.4.Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC và COSY chính (b) của hợp chất
1 ………………………………………………………………………………………………………………..71
Hình 3.5. Tương tác NOESY chính của hợp chất 1 …………………………………………..71
Hình 3.6. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC chính (b) của hợp chất 2 ……..74
Hình 3.7. Tương tác NOESY chính của hợp chất 2 …………………………………………..74
Hình 3.8. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC và COSY chính (b) của hợp chất
3 ………………………………………………………………………………………………………………..76
Hình 3.9. Tương tác NOESY chính của hợp chất 3 …………………………………………..76
Hình 3.10. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC và COSY chính (b) của hợp chất
4 ………………………………………………………………………………………………………………..78
Hình 3.11. Tương tác NOESY chính của hợp chất 4 …………………………………………78
Hình 3.12. Cấu trúc hóa học (a) và các tương tác HMBC chính (b) của hợp chất 580
Hình 3.13. Cấu trúc hóa học của hợp chất 6…………………………………………………….82
Hình 3.14. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất 7 ……………..83
Hình 3.15. Tương tác NOESY chính của hợp chất 7 …………………………………………84
Hình 3.16. Cấu trúc hóa học của hợp chất 8…………………………………………………….85
Hình 3.17. Cấu trúc hóa học của hợp chất 9…………………………………………………….86
Hình 3.18. Cấu trúc hóa học của hợp chất 10…………………………………………………..87
Hình 3.19. Cấu trúc hóa học (a), tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất 11
………………………………………………………………………………………………………………….88
Hình 3.20. Tương tác NOESY chính của hợp chất 11 ………………………………………90
Hình 3.21. Cấu trúc hóa học của hợp chất 12…………………………………………………..91
Hình 3.22. Cấu trúc hóa học của hợp chất 13…………………………………………………..92
Hình 3.23. Cấu trúc hóa học của hợp chất 14…………………………………………………..93
Hình 3.24. Cấu trúc hóa học của hợp chất 15…………………………………………………..94
Hình 3.25. Cấu trúc hóa học của hợp chất 16…………………………………………………..96
Hình 3.26. Cấu trúc hóa học của hợp chất 17…………………………………………………..97
Hình 3.27. Cấu trúc hóa học của hợp chất 18…………………………………………………..98xi
Hình 3.28. Cấu trúc của hợp chất 19, 5,7-diepi-2a-hydroxyoplopanon (19a) và 5,7-
diepi-2a-acetoxyoplopanon (19b) ………………………………………………………………….99
Hình 3.29. Tương tác HMBC (a), NOESY (b) chính của hợp chất 19 ……………….100
Hình 3.30. Phổ ECD tính toán lý thuyết và ECD thực nghiệm của hợp chất 19….101
Hình 3.31. Cấu trúc hóa học của hợp chất 20…………………………………………………102
Hình 3.32. Cấu trúc hóa học của hợp chất 21…………………………………………………103
Hình 3.33. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất 22 ………….105
Hình 3.34. So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất 22 với paludolon và 5-epipaludolon ………………………………………………………………………………………………….105
Hình 3.35. Cấu trúc hóa học của hợp chất 23…………………………………………………106
Hình 3.36. Tương tác NOESY chính của hợp chất 24 …………………………………….108
Hình 3.37. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất 24 ………….107
Hình 3.38. Cấu trúc hóa học của hợp chất 25…………………………………………………109
Hình 3.39. Cấu trúc hóa học của hợp chất 26…………………………………………………111
Hình 3.40. Cấu trúc hóa học của hợp chất 27…………………………………………………112
Hình 3.41. Cấu trúc hóa học của hợp chất 28…………………………………………………114
Hình 3.42. Ảnh hưởng của hợp chất homalolide A đến mức độ biểu hiện của COX-2
và iNOS ……………………………………………………………………………………………………122
Hình 3.43. Ảnh hưởng của hợp chất homalomenol A đến mức độ biểu hiện của COX-
2 và iNOS …………………………………………………………………………………………………122
Hình 3.44. Tương tác phân tử của Teucmosin với AChE ………………………………..128
Hình 3.45. Sơ đồ tổng hợp các thử nghiệm sinh học……………………………………….129
Hình 4.1. Cấu trúc của các hợp chất có hoạt tính kháng viêm in vitro……………….146
Hình 4.2. Cấu trúc của teucmosin và homalolide A………………………………………..151
Hình 4.3. Cấu trúc của 1α,4β,7β-eudesmantriol (1); 1β,4β,7β-eudesmantriol (2) và
1β,4β,7α-eudesmantriol (hợp chất 9)…………………………………………………………….15