Nghiên cứu thực nghiệm điều trị thương tổn da giống vảy nến trên mô hình chuột bằng ghép tế bào gốc từ mô mỡ cùng loài

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu thực nghiệm điều trị thương tổn da giống vảy nến trên mô hình chuột bằng ghép tế bào gốc từ mô mỡ cùng loài. Vảy nến là một bệnh da do viêm mạn tính, ảnh hưởng 2% -3% dân số toàn thế giới. Bệnh gây tổn thương ở da, móng, gây phá hủy khớp và liên quan đến nhiều bệnh đồng mắc, tác động xấu đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân và hiện vẫn chưa có phương pháp điều trị hiệu quả lâu dài. Mặc dù sinh bệnh học của vảy nến vẫn còn chưa được hiểu rõ, nhưng nhiều bằng chứng cho thấy bất thường tế bào T thông qua con đường tế bào T giúp đỡ 17 (T helper 17– Th17) đóng vai trò chính trong sinh bệnh học vảy nến.1 Gần đây, tác nhân kháng interleukin (IL)-17A và IL-23 được chứng minh là đạt hiệu quả trong điều trị vảy nến cho thấy trục IL-23/ IL-17 là đích tác động hiệu quả cho điều trị bệnh này.2
Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cells – MSC) có thể được phân lập từ tủy xương, máu cuống rốn, mô mỡ… Những tế bào này đã được chứng minh có khả năng ức chế tăng sinh, biệt hóa tế bào T CD4+, ức chế trưởng thành tế bào tua gai và tạo điều kiện biệt hóa tế bào T điều hòa (Regulatory T cell – Treg).3,4 Vì thế, MSC đã được nghiên cứu trong điều trị nhiều bệnh lý miễn dịch do tính điều hoà miễn dịch của chúng. Thật vậy, một số nghiên cứu cho thấy MSC có thể ức chế hình thành hay cải thiện các biểu hiện bệnh lý trên một số mô hình chuột mang bệnh tự miễn, như viêm não tủy tự miễn,5 hay lupus ban đỏ.6,7 Cơ chế bệnh sinh của vảy nến cũng liên quan đến tế bào Th17 như trong một số các bệnh lý tự miễn này nên MSC có thể là một trị liệu hiệu quả trong điều trị vảy nến. Vì lý do đó, một số nghiên cứu trên thế giới về điều trị mô hình vảy nến trên chuột bằng MSC đã được thực hiện trong những năm gần đây và cho kết quả khả quan.8,9,10,11 Theo đó, MSC làm giảm thương tổn da giống vảy nến và làm giảm các cytokine tiền viêm như IL-6, IL-17, TNF-a (Tumor necrosis factor – TNF). Bên cạnh đó, MSC cũng làm giảm các chemokine như CCL17 (CC chemokine ligand – CCL), CCL20, CCL27 trên thương tổn da giống vảy nến ở mô hình chuột.12,13,14

Trong số các nguồn thu MSC, mô mỡ là nơi có nguồn tế bào gốc dồi dào,15 việc thu nhận mô mỡ dễ dàng, ít xâm lấn cho người bệnh, cũng như sẵn có khi sử dụng trong ghép đồng loài. Ngoài ra, tế bào gốc từ mô mỡ có tốc độ tăng sinh cao và ổn định về mặt di truyền.16,17 Bên cạnh đó, MSC từ mô mỡ cũng được chứng minh là có khả năng tiết ra một lượng lớn các cytokine, yếu tố tăng trưởng ưu việt hơn các nguồn mô khác.18,19 Do đó, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ đã trở thành một trong những lựa chọn thu hút nhiều nghiên cứu trong các liệu pháp trị liệu tế bào nói chung hay các trị liệu tế bào dành cho vảy nến nói riêng hiện nay.
Theo hiểu biết của chúng tôi, hiện nay, trên thế giới có rất ít các nghiên cứu đánh giá hiệu quả của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ trong cải thiện thương tổn da giống vảy nến trên mô hình chuột, các kết quả đưa ra cũng chưa so sánh được hiệu quả khi sử dụng các liều tế bào gốc khác nhau với các đường dùng khác nhau.20,21 Bên cạnh đó, tại Việt Nam, cũng chưa có nghiên cứu nào đánh giá về vấn đề này. Vậy hiệu quả của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ trong cải thiện thương tổn da giống vảy nến trên mô hình chuột thế nào? Sự thay đổi hiệu quả khi dùng các liều tế bào khác nhau với các đường dùng khác nhau ra sao? Để trả lời cho câu hỏi này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu thực nghiệm điều trị thương tổn da giống vảy nến trên mô hình chuột bằng ghép tế bào gốc từ mô mỡ cùng loài” với những mục tiêu sau:
1. Đánh giá biểu hiện da và cytokine ở thương tổn da giống vảy nến trên mô hình
chuột theo thời gian bôi Imiquimod
2. Khảo sát sự cải thiện thương tổn da giống vảy nến do cảm ứng với Imiquimod
trên mô hình chuột bằng ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ đồng loàI

 MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ………………………………………………………………………………………………..i
Lời cam đoan…………………………………………………………………………………………….ii
Danh mục các chữ viết tắt và đối chiếu thuật ngữ Anh – Việt…………………………v
Danh mục các bảng …………………………………………………………………………………..ix
Danh mục các hình…………………………………………………………………………………….x
Danh mục các biểu đồ, sơ đồ …………………………………………………………………….xii
ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………………………………….1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………………….3
1.1 Tổng quan về vảy nến…………………………………………………………………………3
1.2 Tổng quan về tế bào gốc và tế bào gốc trung mô ………………………………….21
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………..35
2.1 Thiết kế nghiên cứu ………………………………………………………………………….35
2.2 Đối tượng nghiên cứu……………………………………………………………………….35
2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ………………………………………………………35
2.4 Cỡ mẫu của nghiên cứu …………………………………………………………………….35
2.5 Các biến số chính cần thu thập …………………………………………………………..36
2.6 Phương pháp và công cụ đo lường, thu thập số liệu………………………………38
2.7 Sơ đồ nghiên cứu ……………………………………………………………………………..56
2.8 Phương pháp phân tích dữ liệu…………………………………………………………..57
2.9 Đạo đức trong nghiên cứu. ………………………………………………………………..57
Chương 3. KẾT QUẢ…………………………………………………………………………58
3.1 Biểu hiện da và cytokine ở thương tổn da giống vảy nến của chuột theo thời
gian bôi Imiquimod ………………………………………………………………………….58
3.2 Hiệu quả cải thiện thương tổn da giống vảy nến do cảm ứng với Imiquimod
trên mô hình chuột bằng ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ đồng loài….72
Chương 4. BÀN LUẬN …………………………………………………………………….122
iv
4.1 Biểu hiện da và cytokine ở thương tổn da giống vảy nến trên mô hình chuột
theo thời gian bôi Imiquimod …………………………………………………………..122
4.2 Hiệu quả cải thiện thương tổn da giống vảy nến trên mô hình chuột bằng ghép
tế bào gốc trung mô từ mô mỡ đồng loài……………………………………………128
KẾT LUẬN ………………………………………………………………………………………….147
KIẾN NGHỊ …………………………………………………………………………………………148
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

 DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Trang
Bảng 2.1 Bảng theo dõi đánh giá tạo mô hình vảy nến trên chuột ………………….41
Bảng 2.2 Bảng theo dõi đánh giá ghép mADSC trên mô hình chuột ………………47
Bảng 3.1 Tình trạng sức khoẻ của các nhóm chuột sau tiêm ADSC hoặc PBS dưới
da …………………………………………………………………………………………………96
Bảng 3.2 Tình trạng sức khoẻ của các nhóm chuột sau tiêm ADSC hoặc PBS tĩnh
mạch …………………………………………………………………………………………..114
Bảng 3.3 So sánh sự cải thiện điểm số độ nặng thương tổn da giống vảy nến ở
chuột tiêm ADSC dưới da và tiêm ADSC đường tĩnh mạch ………………116
Bảng 3.4 So sánh sự cải thiện độ dày thượng bì trên mô học thương tổn da giống
vảy nến ở chuột tiêm ADSC dưới da và tiêm ADSC đường tĩnh mạch..118 Bảng 3.5 So sánh sự cải thiện điểm số mô bệnh học thương tổn da giống vảy nến
ở chuột tiêm ADSC dưới da và tiêm ADSC đường tĩnh mạch ……………118
Bảng 3.6 So sánh sự cải thiện mức độ phát huỳnh quang của IL-17A và IL-23 trên thương tổn da giống vảy nến ở chuột tiêm ADSC dưới da và tiêm ADSC
đường tĩnh mạch…………………………………………………………………………..121
Bảng 3.7 So sánh sự biểu hiện gen IL-17A, IL-23 trên thương tổn da giống vảy
nến ở chuột tiêm ADSC dưới da và tiêm ADSC đường tĩnh mạch………121
x
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình Trang
Hình 1.1 Cơ chế bệnh sinh của vảy nến ……………………………………………………….6
Hình 1.2 Mô bệnh học của vảy nến mảng …………………………………………………….8
Hình 1.3 Biểu hiện lâm sàng của vảy nến mảng ……………………………………………9
Hình 1.4 Vảy nến mảng toàn thân trước và sau điều trị với tế bào gốc trung mô từ
mô mỡ…………………………………………………………………………………………..34
Hình 2.1 Buồng đếm hồng cầu ………………………………………………………………….54
Hình 3.1 Thay đổi biểu hiện da lưng chuột theo thời gian bôi IMQ ……………….58
Hình 3.2 Đặc điểm mô học của da lưng chuột theo thời gian bôi IMQ …………..63
Hình 3.3 Đặc điểm mô bệnh học của thương tổn da lưng chuột vào ngày thứ 6 ở
độ phóng đại lớn ……………………………………………………………………………64
Hình 3.4 Thâm nhiễm IL-17A và IL-23 ở thương tổn da lưng chuột vào ngày
6 …………………………………………………………………………………………………..70
Hình 3.5 Thâm nhiễm IL-17A và IL-23 ở thương tổn da lưng chuột vào ngày
12 …………………………………………………………………………………………………71
Hình 3.6 Hình dạng của tế bào mADSC qua các thế hệ nuôi cấy in vitro ……….73
Hình 3.7 Kết quả Flow cytometry đánh giá biểu hiện các dấu ấn bề mặt của
mADSC thế hệ 7 trong nuôi cấy in vitro……………………………………………74
Hình 3.8 Khả năng biệt hóa thành tế bào xương, sụn, mỡ của mADSC ………….74
Hình 3.9 Thay đổi đặc điểm biểu hiện da lưng chuột các nhóm chuột theo thời
gian sau tiêm ADSC dưới da……………………………………………………………76
Hình 3.10 Thay đổi đặc điểm mô học da lưng chuột các nhóm chuột theo thời gian
sau tiêm ADSC dưới da…………………………………………………………………..82
Hình 3.11 Thay đổi đặc điểm mô học da lưng ở các nhóm chuột vào ngày 6 ở độ
phóng đại lớn trong thí nghiệm đánh giá hiệu quả của tiêm ADSC dưới da
…………………………………………………………………………………………………….83
xi
Hình 3.12 A-B Thâm nhiễm IL-17A và IL-23p19 ở da lưng chuột nghiên cứu vào ngày 6 trong thí nghiệm đánh giá tác động của tiêm ADSC dưới
da …………………………………………………………………………………………….88,89
Hình 3.13 A-B Thâm nhiễm IL-17A và IL-23p19 ở da lưng chuột nghiên cứu vào ngày 12 trong thí nghiệm đánh giá hiệu quả của tiêm ADSC dưới
da …………………………………………………………………………………………….90,91
Hình 3.14 Thay đổi biểu hiện da lưng chuột theo thời gian ở các nhóm chuột trong
thí nghiệm đánh giá tác động của tiêm ADSC tĩnh mạch …………………….98
Hình 3.15 Thay đổi đặc điểm mô học của da lưng chuột theo thời gian bôi IMQ
trong thí nghiệm đánh giá tác động của tiêm ADSC tĩnh mạch…………..101
Hình 3.16 Thay đổi đặc điểm mô học vùng da lưng trên mẫu nhuộm H&E ở các nhóm chuột vào ngày 6 ở độ phóng đại lớn trong thí nghiệm đánh giá tác
động của tiêm ADSC tĩnh mạch……………………………………………………..102
Hình 3.17 A-B Thâm nhiễm IL-17A và IL-23 ở da lưng chuột nghiên cứu vào ngày 6 trong thí nghiệm đánh giá tác động của tiêm ADSC tĩnh
mạch …………………………………………………………………………………….107,108
Hình 3.18 A-B Thâm nhiễm IL-17A và IL-23 ở da lưng chuột nghiên cứu vào ngày 12 trong thí nghiệm đánh giá tác động của tiêm ADSC tĩnh
mạch …………………………………………………………………………………….109,110
Hình 3.19 So sánh thay đổi biểu hiện da lưng chuột giữa các nhóm chuột tiêm
dưới da ADSC và tiêm tĩnh mạch ADSC…………………………………………115
Hình 3.20 So sánh thay đổi đặc điểm mô học da lưng chuột giữa các nhóm chuột
tiêm dưới da ADSC và tiêm tĩnh mạch ADSC………………………………….117
Hình 3.21 So sánh mức độ thâm nhiễm IL-17A và IL-23p19 ở da lưng chuột nghiên cứu vào ngày 6 giữa các nhóm chuột tiêm dưới da ADSC và tiêm
tĩnh mạch ADSC ………………………………………………………………………….119
Hình 3.22 So sánh mức độ thâm nhiễm IL-17A và IL-23p19 ở da lưng chuột nghiên cứu vào ngày 12 giữa các nhóm chuột tiêm dưới da ADSC và tiêm
tĩnh mạch ADSC ………………………………………………………………………….120
xii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ
Sơ đồ, biểu đồ Trang
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ nghiên cứu ………………………………………………………………………56
Biểu đồ 3.1 Thay đổi điểm số độ nặng thương tổn da lưng chuột theo thời gian bôi
IMQ …………………………………………………………………………………………….60
Biểu đồ 3.2 Thay đổi điểm số mô bệnh học vảy nến của thương tổn da lưng chuột
theo thời gian bôi IMQ …………………………………………………………………..65
Biểu đồ 3.3 Thay đổi độ dày thượng bì trên mô học của thương tổn da lưng chuột
theo thời gian bôi IMQ ……………………………………………………………………66
Biểu đồ 3.4 Thay đổi biểu hiện mARN của IL-23, IL-17A trên thương tổn da lưng
chuột theo thời gian bôi IMQ …………………………………………………………..68
Biểu đồ 3.5 Mức độ phát huỳnh quang (CTCF) của IL-17A và IL-23 trên thương
tổn da lưng chuột theo thời gian bôi IMQ………………………………………….72
Biểu đồ 3.6 Thay đổi điểm số độ nặng thương tổn da chuột theo thời gian sau tiêm
ADSC dưới da ……………………………………………………………………………….78
Biểu đồ 3.7 Thay đổi điểm số mô bệnh học vảy nến thương tổn da trên các nhóm
chuột theo thời gian sau tiêm ADSC dưới da……………………………………..84
Biểu đồ 3.8 Thay đổi độ dày thượng bì trên mô học thương tổn da trên các nhóm
chuột theo thời gian sau tiêm ADSC dưới da……………………………………..85
Biểu đồ 3.9 Thay đổi mức độ phát huỳnh quang (CTCF) của IL-17Avà IL-23 trên
thương tổn da ở các nhóm chuột vào ngày 6 trong thí nghiệm đánh giá tác
động của tiêm ADSC dưới da…………………………………………………………..92
Biểu đồ 3.10 Thay đổi mức độ phát huỳnh quang (CTCF) của IL-17Avà IL-23
trên thương tổn da ở các nhóm chuột vào ngày 12 6 trong thí nghiệm đánh
giá tác động của tiêm ADSC dưới da………………………………………………..93
Biểu đồ 3.11 Thay đổi biểu hiện gen IL-23, IL-17A của thương tổn da ở các nhóm
chuột theo thời gian sau tiêm ADSC dưới da……………………………………..94
Biểu đồ 3.12 Thay đổi điểm số độ nặng thương tổn da của chuột theo thời gian sau
tiêm ADSC tĩnh mạch …………………………………………………………………….99
xiii
Biểu đồ 3.13 Thay đổi điểm số mô bệnh học vảy nến thương tổn da trên các nhóm
chuột theo thời gian sau tiêm ADSC tĩnh mạch ………………………………..104
Biểu đồ 3.14 Thay đổi độ dày thượng bì trên mô học thương tổn da trên các nhóm
chuột theo thời gian sau tiêm ADSC tĩnh mạch ………………………………..105
Biểu đồ 3.15 Thay đổi mức độ phát huỳnh quang (CTCF) của IL-17Avà IL-23 trên trên thương tổn da ở các nhóm chuột vào ngày 6 trong thí nghiệm đánh
giá tác động của tiêm ADSC tĩnh mạch …………………………………………..111
Biểu đồ 3.16 Thay đổi mức độ phát huỳnh quang (CTCF) của IL-17Avà IL-23 trên trên thương tổn da ở các nhóm chuột vào ngày 12 trong thí nghiệm
đánh giá tác động của tiêm ADSC tĩnh mạch …………………………………..112
Biểu đồ 3.17 Thay đổi biểu hiện gen IL-23, IL-17A của thương tổn da ở các nhóm
chuột theo thời gian sau tiêm ADSC tĩnh mạch ………………………………..11