Nghiên cứu tính đa hình gen mã hóa thụ thể vitamin D ở một số thể bệnh lâm sàng do nhiễm vi rút viêm gan B

Nghiên cứu tính đa hình gen mã hóa thụ thể vitamin D ở một số thể bệnh lâm sàng do nhiễm vi rút viêm gan B.Việt Nam là một trong những nƣớc có tỷ lệ nhiễm vi rút viêm gan B (VRVGB) cao trên thế giới với tỷ lệ HBsAg dƣơng tính dao động từ 10-20% trong cộng đồng [1]. Diễn biến tự nhiên và hậu quả lâm sàng của nhiễm VRVGB rất đa dạng có thể là ngƣời mang vi rút không triệu chứng, viêm gan B mạn tính (VGBMT), xơ gan (XG) và ung thƣ biểu mô tế bào gan (UTBMTBG). Yếu tố và nguyên nhân nào dẫn đến những diễn biến và hậu quả lâm sàng khác nhau đó cho đến nay vẫn còn nhiều tranh luận. Bằng chứng cho thấy VRVGB là vi rút không gây tổn thƣơng trực tiếp tế bào gan, tổn thƣơng gan là do hậu quả của quá trình đáp ứng miễn dịch của cơ thể chống lại vi rút.

Vitamin D đƣợc xem là một hormone steroid có vai trò quan trọng trong việc điều hòa chuyển hóa canxi và phosphate cần thiết cho quá trình chuyển hóa xƣơng và nhiều chức năng sinh học khác trong đó có chức năng miễn dịch. Chức năng của vitamin D đƣợc thực hiện thông qua sự liên kết với thụ thể vitamin D (vitamin D receptor, VDR). VDR là một thụ thể, khi đƣợc kích hoạt thông qua các trình tự đặc hiệu nằm ở các vùng gen khởi động sẽ điều hòa sự biểu hiện phiên mã của các gen đích. Sự biểu hiện của VDR trên nhiều tế bào miễn dịch và nhiều mô cơ quan khác nhau trong cơ thể, do đó thông qua VDR mà Vitamin D có thể liên quan đến các con đƣờng tín hiệu sinh học, đáp ứng miễn dịch trong nhiều bệnh lý bao gồm ung thƣ, rối loạn chuyển hóa và bệnh truyền nhiễm [2].
Trong số các biến thể của gen mã hoá VDR (VDR), ngƣời ta thấy bốn biến thể: FokI (rs2228570C>T), BsmI (rs1544410T>C), ApaI (rs7975232G>T) và TaqI (rs731236T>C) là có liên quan nhiều đến cơ chế bệnh sinh của một số bệnh lý mạn tính, ung thƣ, truyền nhiễm [3], [4]. Tuy nhiên, trong bệnh lý nhiễm VRVGB thì kết quả nghiên cứu vẫn còn chƣa thống nhất [5], [6], [7], [8], [9]. Thêm vào đó, các nghiên cứu cho thấy thiếu hụt vitamin D là rất phổ biến ở bệnh nhân viêm gan do các nguyên nhân khác nhau [10], [11]. Tuy nhiên, cơ chế sinh lý bệnh liên quan giữa vitamin D với viêm gan vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ [12], [13], [14], [15], [16].
Ở Việt Nam chƣa có nghiên cứu nào tìm hiểu mối liên quan giữa các biến thể FokI, BsmI, ApaI và TaqI của VDR cũng nhƣ ảnh hƣởng của thiếu hụt vitamin D huyết thanh đối với bệnh lý viêm gan do nhiễm VRVGB. Do đó, chúng tôi nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu tính đa hình gen mã hóa thụ thể vitamin D ở một số thể bệnh lâm sàng do nhiễm vi rút viêm gan B” với hai mục tiêu sau:
1. Xác định mối liên quan của một số biến thể (FokI, BsmI, ApaI và TaqI) gen mã hóa thụ thể vitamin D với tình trạng viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan do nhiễm VRVGB.
2. Khảo sát nồng độ vitamin D huyết thanh ở bệnh nhân viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan do nhiễm VRVGB

MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………………………………… 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………………………….. 3
1.1. NHIỄM VI RÚT VIÊM GAN B VÀ TIẾN TRIỂN LÂM SÀNG…….. 3
1.1.1. Tình hình nhiễm vi rút viêm gan B trên thế giới và Việt Nam……. 3
1.1.2. Quá trình tiến triển bệnh ở ngƣời nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính …5
1.2. TỔNG QUAN VỀ VITAMIN D ………………………………………………….. 7
1.2.1. Bản chất hóa học và chuyển hóa của vitamin D ……………………….. 7
1.2.2. Vai trò của vitamin D trong hệ miễn dịch của cơ thể ………………. 11
1.3. SỰ THIẾU HỤT VITAMIN D…………………………………………………… 13
1.3.1. Dịch tễ học về tình trạng thiếu vitamin D………………………………. 13
1.3.2. Thiếu hụt vitamin D ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính…………… 15
1.3.3. Mối liên quan giữa thiếu hụt vitamin D và xơ gan ………………….. 16
1.3.4. Mối liên quan giữa thiếu hụt vitamin D và ung thƣ biểu mô tế bào gan..17
1.4. ĐA HÌNH GEN VDR VÀ BỆNH LÝ GAN DO NHIỄM VI RÚT
VIÊM GAN B MẠN TÍNH ………………………………………………………. 18
1.4.1. Các biến thể đa hình của VDR ……………………………………………… 18
1.4.2. Tính đa hình gen VDR trong viêm gan mạn do nhiễm vi rút
viêm gan B ………………………………………………………………………… 21
1.4.3. Đa hình gen VDR và xơ hóa gan…………………………………………… 231.4.4. Đa hình gen VDR và ung thƣ gan …………………………………………. 24
1.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐA HÌNH GEN …………. 26
1.5.1. Định nghĩa đa hình đơn nucleotide ………………………………………….. 26
1.5.2. Phƣơng pháp điện di …………………………………………………………… 27
1.5.3. Phƣơng pháp realtime PCR………………………………………………….. 31
1.5.4. Phƣơng pháp giải trình tự Sanger …………………………………………. 31
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………….. 33
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ……………………………………………………. 33
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu …………………………………………………………. 33
2.1.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán các nhóm bệnh nhân nhiễm vi rút viêm gan
B mạn tính………………………………………………………………………….. 33
2.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ ……………………………………………………………… 36
2.1.4. Cỡ mẫu nghiên cứu …………………………………………………………….. 36
2.1.5. Phân loại mức độ xơ gan và ung thƣ gan……………………………….. 37
2.1.6. Mẫu bệnh phẩm nghiên cứu…………………………………………………. 38
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………………………………………. 39
2.2.1. Thiết kế và sơ đồ nghiên cứu ……………………………………………….. 39
2.2.2. Nội dung nghiên cứu…………………………………………………………… 40
2.3. PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU……………………………………………. 51
2.4. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU………………………………. 52
2.5. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU ……………………………………………………….. 52
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………………………………………………. 53
3.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA CÁC ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU …… 53
3.1.1. Đặc điểm lâm sàng……………………………………………………………… 53
3.1.2. Đặc điểm phân bố về tuổi của các nhóm nghiên cứu ………………. 53
3.1.3. Phân bố giới tính của các nhóm nghiên cứu …………………………… 53
3.1.4. Đặc điểm cận lâm sàng ở nhóm bệnh nhân viêm gan B…………… 543.2. PHÂN BỐ KIỂU GEN VÀ ALEN CỦA CÁC BIẾN THỂ VDR
APAI, FOKI, TAQI VÀ BSMI Ở CÁC NHÓM NGHIÊN CỨU …….. 54
3.2.1. Đa hình VDR ApaI ……………………………………………………………… 55
3.2.2. Đa hình VDR FokI………………………………………………………………. 66
3.2.3. Đa hình VDR BsmI……………………………………………………………… 68
3.2.4. Đa hình VDR TaqI………………………………………………………………. 71
3.3. PHÂN BỐ HAPLOTYPE Ở CÁC NHÓM NGHIÊN CỨU …………… 73
3.3.1. Phân bố haplotype (FokI/BsmI/ApaI/TaqI) ở các nhóm nghiên cứu ….73
3.3.2. Mối liên quan giữa các haplotype và các chỉ số cận lâm sàng ….. 77
3.4. ĐẶC ĐIỂM VỀ NỒNG ĐỘ VITAMIN D Ở CÁC NHÓM
NGHIÊN CỨU ………………………………………………………………… 77
3.4.1. Thiếu hụt vitamin D ở nhóm khỏe mạnh và nhóm bệnh nhân ….. 77
3.4.2. Thiếu hụt vitamin D ở nhóm bệnh nhân viêm gan B mạn tính, xơ
gan và ung thƣ biểu mô tế bào gan………………………………………….. 78
3.4.3. Phân bố nồng độ vitamin D theo kiểu gen của các biến thể VDR 82
3.4.4. Mối liên quan giữa biến thể VDR và nồng độ vitamin D với các
thông số cận lâm sàng…………………………………………………………. 84
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN…………………………………………………………………… 86
4.1. ĐA HÌNH GEN VDR TRONG BỆNH LÝ VIÊM GẠN MẠN
TÍNH DO VI RÚT VIÊM GAN B …………………………………………….. 88
4.1.1. Mối liên quan giữa tính đa hình gen VDR đối với nguy cơ
nhiễm vi rút viêm gan B và biểu hiện lâm sàng ……………………… 88
4.1.2. Mối liên quan giữa tính đa hình gen VDR và mức độ nặng của
bệnh lý gan mạn tính…………………………………………………………… 96
4.2. MỐI LIÊN QUAN GIỮA CÁC HAPLOTYPE CỦA VDR VÀ
VIÊM GAN B MẠN TÍNH ………………………………………………………. 974.3. THIẾU HỤT VITAMIN D VÀ TIẾN TRIỂN BỆNH Ở NGƢỜI
NHIỄM VI RÚT VIÊM GAN B MẠN TÍNH……………………………. 100
KẾT LUẬN……………………………………………………………………………………… 109
KIẾN NGHỊ …………………………………………………………………………………….. 111
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ………………………………………………………………….. 112
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Tên bảng Trang
1.1. Phân bố kiểu alen của bốn biến thể theo khu vực địa lý………………….. 19
1.2. Phân tích tổng hợp của Uitterlinden và cộng sự…………………………….. 21
2.1. Đánh giá chức năng gan theo Child – Pugh …………………………………… 37
2.2. Phân chia giai đoạn ung thƣ gan theo phân loại Barcelona……………… 37
2.3. Trình tự các mồi đặc hiệu thực hiện tetra primer ARMS-PCR ………… 49
2.4. Trình tự các mồi đƣợc sử dụng trong kỹ thuật giải trình tự gen……….. 50
3.1. Phân bố về tuổi ở các nhóm nghiên cứu ……………………………………….. 53
3.1. Phân bố giới tính ở các nhóm nghiên cứu …………………………………….. 53
3.2. Đặc điểm cận lâm sàng ở bệnh nhân viêm gan B…………………………… 54
3.3. Phân bố kiểu gen biến thể VDR ApaI giữa các nhóm nghiên cứu ………… 56
3.4. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ nhiễm vi rút viêm gan B ……………….. 57
3.5. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ viêm gan B mạn tính ……………………. 58
3.6. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ xơ gan ………………………………………… 59
3.7. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ xơ gan ………………………………………… 60
3.8. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ ung thƣ biểu mô tế bào gan ………………. 61
3.9. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ ung thƣ biểu mô tế bào gan …………… 62
3.10. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ ung thƣ biểu mô tế bào gan ………………. 63
3.11. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ ung thƣ biểu mô tế bào gan …………… 64
3.12. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ tiến triển bệnh gan………………………… 65
3.13. Phân bố kiểu gen của biến thể VDR FokI ở các nhóm đối tƣợng
nghiên cứu………………………………………………………………………………… 67
3.14. Phân bố kiểu gen của biến thể VDR BsmI ở các nhóm đối tƣợng
nghiên cứu………………………………………………………………………………… 70
3.15. Phân bố kiểu gen của biến thể VDR TaqI ở các nhóm đối tƣợng
nghiên cứu………………………………………………………………………………… 72Bảng Tên bảng Trang
3.16. Phân bố haplotype ở nhóm ngƣời khỏe mạnh và nhóm bệnh nhân
nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính ……………………………………………….. 73
3.17. Phân bố các haplotype điển hình ở các nhóm bệnh nhân ………………… 74
3.18. Phân bố các haplotype điển hình ở nhóm bệnh nhân UTBMTBG và
nhóm không UTBMTBG……………………………………………………………. 75
3.19. Phân bố các haplotype điển hình ở nhóm bệnh nhân VGBMT và
UTBMTBG+XG ……………………………………………………………………….. 76
3.20. Thiếu hụt vitamin D ở nhóm khỏe mạnh và nhóm bệnh nhân …………. 77
3.21. Phân bố thiếu hụt vitamin D theo nhóm bệnh ……………………………….. 78
3.22. Phân loại mức độ thiếu hụt vitamin D ở nhóm chứng và nhóm bệnh…….80
3.23. Mức độ thiếu hụt vitamin D theo các nhóm bệnh…………………………… 81
3.24. Tỷ lệ thiếu hụt vitamin D theo giới tính ở nhóm ngƣời khỏe mạnh….. 81
3.25. Tỷ lệ thiếu hụt vitamin D theo giới tính ở ngƣời nhiễm vi rút viêm
gan B ……………………………………………………………………………………….. 

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ
Hình Tên hình Trang
1.1. Tình hình dịch tễ nhiễm VRVGB trên thế giới ……………………………….. 4
1.2. Phân bố số ca mắc viêm gan B theo quốc gia………………………………….. 4
1.3. Tỉ lệ mắc mới (A) và tử vong (B) của UTBMTBG trong tổng số các
bệnh ung thƣ trên thế giới. ……………………………………………………………. 6
1.4. Tỉ lệ mắc mới ung thƣ gan ở Việt Nam ………………………………………….. 7
1.5. Sơ đồ tóm tắt quá trình chuyển hóa vitamin D trong cơ thể………………. 9
1.6. Tóm tắt cơ chế chứng minh vai trò của vitamin D trong đáp ứng
miễn dịch của cơ thể ………………………………………………………………….. 11
1.7. Phân bố tình trạng thiếu hụt vitamin D trên thế giới ………………………. 14
1.8. Minh họa cấu trúc của VDR và vị trí các các biến thể. …………………… 19
1.9. Nguyên lý phƣơng pháp Tetra-primer ARMS PCR. ………………………. 30
2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu …………………………………………………………… 39
2.2. Máy PCR thƣờng thực hiện kĩ thuật Tetra-primer ARMS ………………. 44
2.3. Máy giải trình tự gen ABI 3130 XL 16 kênh màu………………………….. 45
2.4. Hệ thống máy chạy Elisa ……………………………………………………………. 45
3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đại diện xác định kiểu gen ApaI………… 55
3.2. Giải trình tự đại diện xác định kiểu gen của biến thể ApaI ……………… 56
3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đại diện xác định kiểu gen FokI ………… 66
3.4. Giải trình tự đại diện xác định kiểu gen của biến thể FokI………………. 66
3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đại diện xác định kiểu gen BsmI…… 68
3.6. Giải trình tự đại diện xác định kiểu gen của biến thể VDR BsmI…….. 69
3.7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đại diện xác định kiểu gen TaqI……. 71
3.8. Giải trình tự đại diện các kiểu gen của biến thể TaqI……………………… 71
3.9. So sánh đặc điểm sinh hóa giữa các haplotype phổ biến…………………. 77Hình Tên hình Trang
3.10. So sánh nồng độ vitamin D giữa nhóm bệnh nhân và nhóm NKM……….. 78
3.11. Phân bố nồng độ vitamin D giữa có nhóm bệnh nhân nhiễm
VRVGB mạn tính………………………………………………………………………. 79
3.12. Nồng độ vitamin D nhóm viêm gan B mạn và nhóm UTBMTBG+XG……79
3.13. Nồng độ vitamin D ở nhóm bệnh UTBMTBG và không UTBMTBG 80
3.14. Phân bố nồng độ vitamin D theo kiểu gen của biến thể ApaI ………….. 82
3.15. Phân bố nồng độ vitamin D theo kiểu gen của biến thể FokI…………… 83
3.16. Phân bố nồng độ vitamin D theo kiểu gen của biến thể BsmI………….. 83
3.17. Phân bố nồng độ vitamin D theo kiểu gen của biến thể TaqI…………… 84
3.18. Mối tƣơng quan giữa kiểu gen ApaI với các chỉ số cận lâm sàng…………. 8