Nghiên cứu tính đa hình thái đơn của gen ADH1C trên bệnh nhân ung thư gan nguyên phát
Luận văn Nghiên cứu tính đa hình thái đơn của gen ADH1C trên bệnh nhân ung thư gan nguyên phát.Nghiện rượu mạn tính là một trong những nguy cơ cao gây ung thư gan. Khi rượu vào cơ thể, ethanol sẽ được chuyển hóa và tạo thành acetaldehyde, đây là chất gây độc và làm hủy hoại tế bào gan. Acetaldehyde còn là chất gây ung thư do gắn với DNA tạo sản phẩm DNA “adduct” làm cho khối u phát triển [1],[2]. Quá trình tạo ra acetaldehyde từ ethanol được xúc tác bởi enzym alcohol dehydrogenase (ADH), đây là enzym có nhiều biến thể (được gọi isoenzym) trong đó các isoenzym ADH nhóm I chuyển hóa >92% lượng ethanol tại gan [3]. Gen mã hóa cho ADH nhóm I là ADH1A, ADH1B, ADH1C, trong đó gen ADH1B, ADH1C là gen đa hình thái đơn.
Các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh rằng hiện tượng đa hình thái đơn mã hóa cho enzym ADH1C liên quan đến nhiều loại hình ung thư [4]. Năm 1997 Harty và cs đã phát hiện người mang alen ADH1C*1 và kiểu gen đồng hợp tử ADH1C*1/*1, nghiện rượu có nguy cơ ung thư hầu họng tăng gấp 40 lần so với người không sử dụng rượu, trong khi đó với kiểu gen đồng hợp tử ADH1C*2/*2 thì nguy cơ ung thư chỉ gấp 4 lần [5]. Nghiên cứu của Homanm và cs (2006) đã đưa ra kết luận rất thuyết phục là tần số alen ADH1C*1 và kiểu gen ADH1C*1/*1 cao hơn và có ý nghĩa ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan (UTBMTBG) liên quan rượu so với nhóm chứng với (p
Ung thư gan nguyên phát (UTGNP) là khối u sinh ra từ tế bào biểu mô gan và tổ chức liên kết, đại đa số xuất phát từ biểu mô gan (>90%). Hiện nay, ung thư gan là bệnh đứng hàng thứ 5 và là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 3 trong các loại ung thư trên thế giới, ước tính khoảng 500.000 đến 1.000.000 ca mắc mới trong một năm [2]. Phẫu thuật khối u, tiêm cồn hoặc tiêm hóa chất là phương pháp điều trị thông dụng hiện nay cho các bệnh nhân nhằm kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân, tuy nhiên chẩn đoán bệnh thường muộn, nên việc điều trị ít hiệu quả. Do vậy, xác định và kiểm soát yếu tố nguy cơ để có những biện pháp cảnh báo, chẩn đoán sớm và phòng ngừa bệnh là yếu tố then chốt góp phần không nhỏ vào chiến lược ngăn ngừa và phòng chống ung thư gan [7]. Ngoài nguy cơ hay gặp gây UTGNP là nhiễm virut viêm gan B, C… thì yếu tố di truyền gen ADH1C liên quan đến sử dụng rượu kéo dài của bệnh nhân là nguy cơ quan trọng rất cần được đi sâu tìm hiểu và nghiên cứu.
Việt Nam là nước có tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát thuộc nhóm cao nhất thế giới, tình trạng lạm dụng rượu rất cao và khó kiểm soát. Hiện nay, các nghiên cứu mối liên quan giữa đa hình thái gen mã hóa cho enzym ADH với UTGNP chưa được nghiên cứu tìm hiểu một cách đồng bộ và bài bản. Tác giả Vũ Tú Nam (2013) đã nhận thấy tần số alen ADH1C*1 và kiểu gen ADH1C*1/*1 cao hơn với UTBMTBG so với nhóm chứng. Tuy nhiên, do cỡ mẫu nhỏ nên sự khác biệt giữa 2 nhóm chưa có ý nghĩa thống kê [8]. Chính vì vậy, đề tài “Nghiên cứu tính đa hình thái đơn của gen ADH1C trên bệnh nhân ung thư gan nguyên phát ” được thực hiện với mục tiêu cụ thể như sau:
1. Xác định tỷ lệ kiểu gen và alen của gen ADH1C trên bệnh nhân ung thư gan nguyên phát.
2. Khảo sát mối liên quan giữa gen ADH1C với một số yếu tố nguy cơ hay gặp trên bệnh nhân ung gan nguyên phát.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Nghiên cứu tính đa hình thái đơn của gen ADH1C trên bệnh nhân ung thư gan nguyên phát
1. Helmut K. Seitz and Felix Stickel (2010). Alcetaldehyde as an underestimated risk factor for cancer development: role of genetics in ethanol metabolism, Alcohol Research Health. 5(2), 121-128.
2. Iain H. McKillop, Ph.D., Laura W. Schrum, Ph.D (2009). Role of Alcohol in Liver Carcinogenesis, Thieme Medical Publishers. 9(2):222-232.
3. H J Edenberg and W F Bosron (2010). Acohol dehydrogenases, Elsevier Ltm, 4(6),111-126.
4. Helmut K. Seitz, M.D., and Peter Becker (2007), Alcohol Metabolism and Cancer Risk, Alcohol Research & Health, 30 (1), 38-47.
5. Harty LC (1997), et al. Alcohol dehydrogenase 3 genotype and risk of oral cavity and pharyngeal cancers. JNatl Cancer Inst. ;89:1698-1705
6. Homann N., Stickel F. et al (2006). Alcohol dehydrogenase 1C*1 allele is a genetic marker for alcohol-associated cancer in heavy drinkers. International Journal of Cancer, 118(8), 1998-2002
7. Hà Văn Mạo, Hoàng Kỷ, Phạm Hoàng Phiệt (2006), Ung thư gan nguyên phát. Nhà xuất bản y học. 15-42.
8. Vũ Tú Nam (2013). Hoàn thiện quy trình và bước đầu xác định tính đa hình thái đơn của gen ADH1C bằng kỹ thuật PCR-RFLP”. 15-19
9. Trần Văn Huy (2003), Nghiên cứu dấu ấn của các virus viêm gan B, C và đặc điểm cận lâm sàng ung thư biểu mô tế bào gan, 5-12.
10. Nguyễn Cường Thịnh, Lê Văn Thành (2009). Phẫu thuật cắt gan điều trị ung thư tế bào gan. Y học TP.HCM, chuyên đề ung bướu học, 13 (6), 547-555.
11. Okuda.K 1997 Epidemiology in Diagnosis and Treatment of Hepatocellular Carcinoma. Greenwich medical Media. 3-15
12. Pagltaro L, Simonetti RG, Craxi AL et al (1983) Alcohol and HBV infection as risk factors for HCC in Italy, A multicenter controlled study.
Hepatogastroenterology. 30, 48-50.
13. Đào Văn Long (2012), Ung thư biểu mô tế bào gan. Bài giảng nội khoa tập II- Trường Đại học Y Hà Nội, 17-23.
14. Howard J. Edenberg, Ph.D 2007. The Genetics of Alcohol Metabolism, Role of Alcohol Dehydrogenase and Aldehyde Dehydrogenase Variants. Alcohol Reseach Health. 30(1), 5-12.
15. Samir Zakha (2006). Overview: How is alcohol metabolized by the body? Alcohol Research & Health, 29(4), 245-254.
16. Luke O. Dannenberg (2006), Transcriptional regulation of the human class I alcohol dehydrogenase genes, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Indiana University.1-6
17. Tuma, D.J. và Casey, C.A (2003). Dangerous byproducts of alcohol breakdown: Focus on adducts. Alcohol Research & Health 27:285-290.
18. Barry,R.E.; Williams, A.J.; AND Mcgivan, J.D (1987). The detection of acetaldehyde/liver plasma membrane protein adduct formed in vivo by alcohol feeding. Liver 7:364-368.
19. Brooks PJ, Theruvathu JA(2006). Acetaldehyde-DNA adducts: implications for the molecular mechanism of alcohol related carcinogenesis. In: Cho CH, Purohit V, editors. Alcohol, tobacco and cancer. Basel: Karger; 78-96.
20. Theravathu JA, Jaruga P, Nath RG, et al (2005). Polyamines stimulate the formation of mutagenic1,N2propanodeoxyguanosinase adducts from acetaldehyde. Nucleic Acids Res.33:3513-3520
21. Bradford, B U (2005). Cytochrome P450 CYP2E1, but not nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase, is required for ethanol-induced oxidative DNA damage in rodent liver. Hepatology 41:336-344.
22. Bordone, L (2005). Calorie restriction, SIRT1 and metabolism: Understanding longevity. Nature 6:298-305, 2005.
23. Stickel, F (2002). Cocarcinogenic effects of alcohol in hepatocarcinogenesis. Gut 51:132-139, 2002.
24. Jelski W (2008). Alcohol dehydrogenase (ADH) isoenzyms and aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity in the sera of patients with liver cancer, 22(3), Clinica Chimica Acta-International Journal of Clinical Chemistry, 395(1-2). 1-5.
25. Andrew J. Birley, et al (2009). ADH single nucleotide polymorphism association with alcohol metabolism in vivo. Human Molecular Genetics, 18(8), 1533-1542
26. Dana Al-Bargash (2008) Effect of alcohol consumption and alcohol dehydrogenase 1C (ADH1C) polymorphisms on total plasma homocystein levels, 7-86
27. Eng M.Y., Luczak S.E., Wall T.L. (2007). ALDH2, ADH1B, and ADH1C genotypes in Asians: a literature review. Alcohol Research & Health, 30(1), 22-27.
28. Vijay A. Ramchandani (2013) Genetics of Alcohol Metabolism. National Institutes of Health 2, 15-25.
29. Terry, M.B.; Gammon, M.D.; Zhang, F.F ;et.al (2006). ADH3 genotype, alcohol intake and breast cancer risk. Carcinogenesis 27(4):840-847.
30. Peters, E.S (2005). ADH1C polymorphism modifies the risk of squamous cell carcinoma of the head and neck associated with alcohol and tobacco use. American Association for Cancer Research. 14: 476-482.
31. Schwartz SM,(2001). Oral squamous cell cancer risk in relation to alcohol consumption and alcohol dehydrogenase-3 genotypes. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev; 10:1137-44,
32. Tiemersma (2003). Alcohol consumption, alcohol dehydrogenase 3 polymorphism, and colorectal adenomas. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 12: 419-425,
33. Yin (2007). Alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase polymorphisms and colorectal cancer: The Fukuoka Colorectal Cancer Study. Cancer Science. 98(8): 1248-1253
34. Genetic variation-National Cancer Institute
35. Trịnh Văn Bảo (2011). Sinh học. Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam. 168-169.
36. Tạ Thành Văn (2010), PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử. Nhà xuất bản y học, 28-50
37. Henrik Berg Rasmussen (2012). Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of PCR-Amplified Fragments (PCR-RFLP) and Gel Electrophoresis – Valuable Tool for Genotyping and Genetic Fingerprinting. Gel
Electrophoresis – Principles andBasics.18.315-320.
38. International guide for monitoring alcohol consumption and related harm. World Health Organization.2 (2). 37-59.
39. Lê Minh Huy (2012). Giải phẫu bệnh và hóa mô miễn dịch các yếu tố tiên lượng của carcinoma tế bào gan. 81-90
40. Quách Thành Hưng, Ngô Văn Vinh, Huỳnh Hùng, La Chí Hải, Nguyễn Cao Cương, Văn Tần (2004). Khảo sát sự tương quan giữa nhiễm viêm ganvirút B,C và sự đột biến của gene ức chế ung thư p53 trong ung thư tế bào gan ở Việt Nam”, Y học TP.HCM. 8, 56-62.
41. Ng IO, Lai EC, Fan ST, et al (1995). Prognostic significance of pathologic features of hepatocelluler carcinoma: a multivariate analysis of 278 patients”. Cancer, 76, 2443-2448.
42. Lauwers Y.G., et al (2002). Prognostic histologic indicators of curatively resected hepatocellular carcinoma. American Journal of surgical Pathology, 26(1), 25-34.
43. Zhang, J. Y et al (1998). A case-control study of hepatitis B and C virus infection as risk for hepatocellular carcinoma in Henan, China. Internationl Journal of Epidemiology, 574-578.
44. Levy I, Sherman M (2002). Liver cancer study group of the University of Toronto. Staging of hepatocellular carcinoma: assesment of the CLIP, Okuda, and Chid-Pugh staging system in a cohort of 257 patients in Toronto”. Gut; 50, 881-5.
45. Gao J.D, Shao YF, Xu Y, Ming LH, Wu ZY, Liu GT, Wang XH, Gao WH, Su YT, Feng XL, Liang LM, Zhang YH, Sun ZT (2005). “Tight association of hepatocellular carcinoma with HBc infection in North China”, Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 4, 46-49.
46. Olshan A.F., Weissler M.C., Watson M.A., Bell D.A. (2001). Risk of head and neck cancer and the alcohol dehydrogenase 3 genotype. Carcinogenis, 22(1), 57-61.
47. Shen, YC; Fan, J.H.; Edenberg, H.J.; et al (1997). Polymorphism of ADH and ALDH genes among four ethnic groups in China and effects upon the risk for alcoholism. Alcoholism: Clinical and Experimental Research 21:1272-1277.
48. Thomasson,H.R.; Crabb, D.W.; Edenberg, H.J.; et al (1994). Low frequency of the ADH2*2 allele among Atayal natives of Taiwan with alcohol use disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research 18:640-643,
49. Brenda, WC., et al (1986). Alcohol consumption, alcohol dehydrogenase 1C (ADH1C ) genotype, and risk of colorectal cancer in the Netherlands Cohort Study on diet and cancer. Alcohol, 18-24.
50. Visapaa J.P. et al (2004). Increased cancer risk in heavy drinkers with the alcohol dehydrogenase 1C *1 allele, possibly due to salivary acetaldehyde. GUT, 53(6), 871-876.
51. Coutelle C, Hohn B, Benesova M, Oneta CM, Quattrochi P, Roth HJ,Schmidt- Gayk H, Schneeweiss A, Bastert G, Seitz HK (2004) Risk factors in alcohol associated breast cancer: alcohol dehydrogenase polymorphism and estrogens. Int J Oncol 25:1127-1132.
52. Lau W. Y (2008). Hepatocellular carcinoma, World Scientific Pub, Hackensack, NJ, 1(9), 215-239.
53. Kim Bảo Giang, et al (2005) The use of Audit to assess level of alcohol problems in rural Viet Nam, Alcohol and Alcoholism.40(6), 578-583.
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Sơ lược về ung thư gan nguyên phát 3
1.1.1 Tỷ lệ mắc UTGNP trên thế giới 3
1.1.2 Các yếu tố nguy cơ 4
1.1.3 Lâm sàng và cận lâm sàngcủa UTGNP 6
1.1.4 Điều trị và tiên lượng UTGNP 8
1.2 Hệ thống enzym ADH và ALDH và chuyển hóa rượu tại gan 9
1.2.1 Hệ thống enzym ADH và ALDH 9
1.2.2 Chuyển hóa rượu tại gan 11
1.2.3 Chuyển hóa rượu và ung thư gan 12
1.3 Sơ lược về gen ADH1C 15
1.3.1 Vị trí và liên quan 15
1.3.2 Cấu trúc và chức năng của ADH1C 16
1.3.3 Tính đa hình thái của gen ADH1C 16
1.3.4 Gen ADH1C và bệnh ung thư 17
1.4 Kỹ thuật xác định đa hình thái đơn gen ADH1C 19
1.4.1 Hiện tượng đa hình thái đơn 19
1.4.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đa hình thái đơn 21
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
2.1 Đối tượng nghiên cứu 27
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29
2.3 Phương pháp nghiên cứu 29
2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 29
2.3.2 Cỡ mẫu 29
2.3.3 Cách thức tiến hành 30
2.3.4 Trang thiết bị và hóa chất 32
2.4 Phương pháp xử lý số liệu 36
2.5 Đạo đức trong nghiên cứu của đề tài 36
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37
3.1 Đặc điểm của nhóm nghiên cứu: 37
3.1.1 Đặc điểm về tuổi: 37
3.1.2 Đặc điểm về giới: 37
3.1.3 Đặc điểm mắc viêm gan B: 38
3.1.4 Tình trạng sử dụng rượu: 39
3.2 Tỷ lệ kiểu gen và alen ADH1C trong nhóm nghiên cứu 40
3.2.1 Kết quả tách chiết DNA: 40
3.2.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarosse 1.5% 41
3.2.3 Kết quả kiểu gen và alen ADH1C 42
3.3 Mối liên quan gen ADH1C với một số yếu tố nguy cơ khác 46
3.3.1 Gen ADH1C và độ tuổi phát hiện bệnh UTGNP của các kiểu gen 46
3.3.2 Mối liên quan của gen ADH1C với giới tính trong nhóm ung thư gan nguyên
phát 46
3.3.3 Mối liên quan của gen ADH1C với tình trạng sử dụng rượu 47
3.3.4 Mối liên quan của gen ADH1C vớí nhiễm virut HBV 49
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 51
4.1 Đặc điểm của nhóm nghiên cứu: 51
4.1.1 Đặc điểm về tuổi của nhóm ung thư gan nguyên phát 51
4.1.2 Đặc điểm về giới của nhóm ung thư gan nguyên phát 52
4.1.3 Đặc điểm mắc viêm gan B của nhóm ung thư gan nguyên phát 53
4.1.4 Tình trạng sử dụng rượu của nhóm nghiên cứu 53
4.1.5 Đặc điểm nhóm chứng của nhóm nghiên cứu 54
4.2 Tỷ lệ kiểu gen và alen ADH1C trong nhóm nghiên cứu 55
4.2.1 Về kết quả tách chiết DNA 55
4.2.2 Kết quả PCR 55
4.2.3 Phương pháp xác định SNP của gen ADH1C bằng kỹ thuật PCR-RFLP 57
4.2.4 Tỷ lệ kiểu gen và alen ADH1C trong nhóm nghiên cứu 58
4.3 Mối liên quan giữa gen ADH1C với một số yếu tố nguy cơ 60
KẾT LUẬN 63
KIẾN NGHỊ 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Hình 1.1: Hình ảnh mô học ung thư biểu mô tế bào gan 7
Hình 1.2: Hình ảnh mô học ung thư biểu mô đường mật đa hình thái 7
Hình 1.3: Ung thư biểu mô gan tế bào gan biệt hóa thấp 7
Hình 1.4: Alcohol dehydrogenase 9
Hình 1.5: Chuyển hóa rượu ở gan và vai trò hình thành ung thư gan 15
Hình 1.6: Vị trí và mối liên quan giữa gen ADH1Cvới các gen ADHkhác…. 16
Hình 1.7: Minh họa hiện tượng đa hình thái đơn gen (SNPs) 20
Hình 1.8: Nguyên lý kỹ thuật PCR 22
Hình 2.1: Minh họa cắt enzym của gen ADH1C 31
Hình 3.1: Điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,8% 41
Hình 3.2: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen ADH1C trên agarose 1.5% 41 Hình 3.3: Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen ADH1C bằng enzym SspI 42 Hình 3.4: Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen ADH1C bằng enzym SspI 43
Hình 3.5: Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR đoạn gen ADH1C của bệnh nhân ung thư gan nguyên phát K131 và K132 44
Hình 3.6: So sánh tỷ lệ kiểu gen ADH1 C*1/*1 trong cả nhóm nghiên cứu, nhóm sử dụng sử dụng rượu vừa và nghiện rượu (nam>40g/ngày, nữ>20g/ngày) và nhóm sử dụng rượu ít (nam<40g/ngày, <nữ 20g/ngày) 48
Bảng 1.1 Các isoenzym ADH ở người 10
Bảng 1.2 Gen ADH1C 16
Bảng 1.3 Vị trí cắt của một số enzym giới hạn 23
Bảng 2.1 Hàm lượng rượu tiêu thụ trung bình trong 1 ngày 28
Bảng 3.1 Đặc điểm tuổi của nhóm nghiên cứu 37
Bảng 3.2 Đặc điểm giới của nhóm nghiên cứu 37
Bảng 3.3 Đặc điểm mắc viêm gan B của nhóm nghiên cứu 38
Bảng 3.4 Tình trạng sử dụng rượu của nhóm nghiên cứu 39
Bảng 3.5 Một số kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của DNA 40
Bảng 3.6 Tỷ lệ kiểu gen ADH1C của 2 nhóm 45
Bảng 3.7 Tỷ lệ kiểu gen và alen ADH1C của 2 nhóm 45
Bảng 3.8 Gen ADH1C và trung vị tuổi phát hiện bệnh của các kiểu gen 46
Bảng 3.9 Gen ADH1C và giới trong nhóm bệnh 46
Bảng 3.10 Gen ADH1C với tình trạng sử dụng rượu 47
Bảng 3.11 Gen ADH1C với nhiễm virut HBV 49
Bảng 4.1 So sánh tuổi trung bình của bệnh nhân UTGNP với các nghiên cứu .. 51
Bảng 4.2 So sánh giới của bệnh nhân UTGNP với các nghiên cứu 52
Bảng 4.3 So sánh tỷ lệ nhiễm HBV của bệnh nhân UTGNP với các nghiên cứu 53 Bảng 4.4 So sánh kiểu gen ADH1C với các nghiên cứu trong nước và trên thế giới . 59 Bảng 4.5 Nguy cơ kiểu gen ADH1C*1/*1 và alen ADH1C*1 với UTGNP .. 61
ADH : Alcohol Dehydrogenase
ADH1A, ADH1B, ADH1C : Alcohol Dehydrogenase 1A, 1B;