Nghiên cứu tình trạng tái phát và tái nhiễm Helicobacter pylori bằng xác định tính đa hình gen UreC ở bệnh nhân loét hành tá tràng

Nghiên cứu tình trạng tái phát và tái nhiễm Helicobacter pylori bằng xác định tính đa hình gen UreC ở bệnh nhân loét hành tá tràng.Nhiễm Helicobacter pylori (H. pylori) là một trong những loại nhiễm khuẩn mãn tính hay gặp nhất ở người [1]. Ước tính đến năm 2015 có khoảng 4,4 tỷ người trên toàn thế giới nhiễm vi khuẩn này [2]. Đã có nhiều nghiên cứu khẳng định vai trò của H. pylori trong cơ chế bệnh sinh của bệnh viêm loét dạ dày tá tràng, u MALT cũng như ung thư dạ dày [3]. Đặc biệt, H. pylori được coi là nguyên nhân chính gây loét dạ dày tá tràng là một bệnh phổ biến trên thế giới cũng như ở nước ta với tỷ lệ mắc chiếm tới 5% đến 10% dân số thế giới [4]. Chính vì vậy, việc tiệt trừ H. pylori giúp điều trị hiệu quả bệnh viêm loét dạ dày tá tràng có nhiễm H. pylori và quan trọng hơn là có thể ngăn ngừa được sự phát triển của ung thư dạ dày [5],[6]. Trong nhiều thập kỷ qua, các phác đồ tiệt trừ H. pylori đã được áp dụng điều trị cho bệnh nhân loét dạ dày tá tràng có nhiễm H. pylori. Tuy nhiên, tiệt trừ hoàn toàn H. pylori là một thách thức với giới y học nói chung và chuyên ngành tiêu hóa nói riêng.

Bằng chứng là tình trạng tái xuất hiện (recurrence) H. pylori sau tiệt trừ gặp ở nhiều quốc gia và khu vực kể cả ở các nước phát triển. Nghiên cứu của Gisbert và CS thấy tỷ lệ tái xuất hiện H. pylori sau tiệt trừ trung bình trên toàn thế giới hàng năm là 4,3% đến 4,5% [7],[8]. Nhìn chung, tỷ lệ này ở các nước đang phát triển cao hơn so với ở các nước phát triển (13% so với 2,7%) [9]. Một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tái xuất hiện H. pylori là hiệu quả của các phác đồ tiệt trừ H. pylori. Vào những năm đầu 1990, tỷ lệ tiệt trừ H. pylori của các phác đồ có thể đạt trên 80% [10]. Tuy nhiên, theo thời gian các phác đồ tiệt trừ H. pylori dần giảm hiệu quả do vi khuẩn kháng kháng sinh ngày càng tăng [11]. Bên cạnh đó, yếu tố phát triển kinh tế xã hội và điều kiện vệ sinh môi trường cũng có mối liên quan mật thiết với tình trạng tái xuất hiện H. pylori sau tiệt trừ [12].2
Có hai hình thức tái xuất hiện H. pylori sau tiệt trừ là tái phát (recrudescence) và tái nhiễm (reinfection). Tái phát là nhiễm lại các chủng H. pylori trước điều trị và tái nhiễm là sau khi tiệt trừ thành công bệnh nhân lại nhiễm lại một chủng H. pylori khác với chủng nhiễm trước điều trị. Phân biệt tái phát và tái nhiễm giúp cho chuyên ngành tiêu hóa có định hướng, có chiến lược điều trị phù hợp. Đối với tái phát, bác sĩ lâm sàng cần thay đổi và lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp. Đối với tái nhiễm, giải pháp là tìm nguyên nhân, các biện pháp phòng như tránh lây nhiễm trong gia đình, cải thiện điều kiện vệ sinh và môi trường sống.
Để chứng minh tình trạng tái nhiễm hay tái phát H. pylori, chúng ta cần phải phân biệt được kiểu gen giữa các chủng nhiễm trước và sau điều trị tiệt trừ. Có nhiều phương pháp sinh học phân tử xác định kiểu gen của vi khuẩn trong đó PCR- RFLP và PCR giải trình tự gen để xác định kiểu gen các chủng H. pylori là hai phương pháp hiện đang được áp dụng phổ biến trong nghiên cứu và thực tiễn lâm sàng. Do kiểu gen của H. pylori có tính đa hình cao nên việc lựa chọn gen xác định chính xác sự hiện diện của H. pylori là rất quan trọng. Các gen hay được lựa chọn là các gen ổn định ở hầu hết các chủng H. pylori như 16S rRNA, UreC, UreA còn được coi là các gen “giữ nhà” (housekeeping genes). Trong đó, phân tích gen UreC được sử dụng trong nhiều nghiên cứu xác định sự hiện diện của H. pylori do có độ đặc hiệu cao và giúp xác định các chủng H. pylori [13].
Nhiều công trình nghiên cứu đã thực hiện tại nhiều quốc gia phân biệt tình trạng tái phát và tái nhiễm H. pylori sau điều trị tiệt trừ vi khuẩn này ở các bệnh nhân loét dạ dày tá tràng cho kết quả rất khác nhau. Tại các nước đã phát triển, các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ tái phát cao hơn tái nhiễm. Trong khi đó ở các nước đang phát triển, tỷ lệ tái nhiễm lại cao hơn [8]. Tại Việt Nam, chưa có nhiều công trình nghiên cứu phân biệt tình trạng tái phát và tái nhiễm
H. pylori bằng phương pháp sinh học phân tử. Xuất phát từ thực tiễn đánh giá3 hiệu quả điều trị tiệt trừ vi khuẩn H. pylori và phân biệt tái nhiễm hay tái phát sau điều trị tiệt trừ H. pylori ở bệnh nhân loét tá tràng – một bệnh phổ biến ở nước ta và có tỷ lệ loét tái phát cao, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tình trạng tái phát và tái nhiễm Helicobacter pylori bằng xác định tính đa hình gen UreC ở bệnh nhân loét hành tá tràng” với hai mục tiêu:
1. Phân tích tỷ lệ kháng Amoxicillin, Clarithromycin và hiệu quả phác đồ Esomeprazole-Amoxicilin-Clarithromycin (EAC) trên bệnh nhân loét tá tràng có Helicobacter pylori dương tính
2. Xác định tình trạng tái phát và tái nhiễm Helicobacter pylori sau điều trị tiệt trừ thành công, bằng kỹ thuật PCR-RFLP và giải trình tự xác định gen Ure

MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các chữ, ký hiệu viết tắt
Danh mục bảng
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………………………………………………..1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU …………………………………………………………..4
1.1. Helicobacter pylori và bệnh loét tá tràng………………………………………….. 4
1.1.1. Helicobacter pylori ……………………………………………………………….. 4
1.1.2. Bệnh loét tá tràng ………………………………………………………………… 12
1.2. Tái nhiễm và tái phát Helicobacter pylori sau điều trị tiệt trừ ……………. 20
1.2.1. Khái niệm tái nhiễm và tái phát vi khuẩn Helicobacter pylori …… 20
1.2.2. Tình hình tái phát và tái nhiễm của H. pylori sau điều trị tiệt trừ .. 21
1.2.3. Các yếu tố liên quan đến tái phát và tái nhễm H. pylori ……………. 24
1.2.4. Ý nghĩa của phân biệt tái nhiễm và tái phát của Helicobacter pylori .. 29
1.3. Các phương pháp phân biệt bộ gen của Helicobacter pylori và phương
pháp PCR –RFLP, giải trình tự gen xác định gen UreC …………………….. 30
1.3.1. Các phương pháp phân tích bộ gen của vi khuẩn H. pylori ……….. 30
1.3.2. Gen UreC …………………………………………………………………………… 30
1.3.3. Phương pháp PCR- RFLP (PCR- Đa hình chiều dài đoạn cắt giới
hạn)…………………………………………………………………………………………….. 32
1.3.4. Phương pháp giải trình tự gen ……………………………………………….. 33
1.3.5. So sánh hai phương pháp PCR –RFLP và giải trình tự gen trong xác
định chủng H. pylori……………………………………………………………………… 36
1.3.6. Các nghiên cứu kiểu gen H. pylori bằng phương pháp PCR-RFLP
và giải trình tự gen ……………………………………………………………………….. 37
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………….40
2.1. Đối tượng nghiên cứu…………………………………………………………………… 402.1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân nghiên cứu………………………………….. 40
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân nghiên cứu ………………………………. 40
2.1.3. Nơi tiến hành nghiên cứu …………………………………………………….. 40
2.2. Phương pháp nghiên cứu ………………………………………………………………. 40
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu……………………………………………………………… 40
2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu ……………………………………………………………… 41
2.2.3. Các bước tiến hành nghiên cứu ……………………………………………… 43
2.2.4. Các chỉ tiêu nghiên cứu………………………………………………………… 50
2.2.5. Phương tiện nghiên cứu………………………………………………………… 54
2.2.6. Xử lý số liệu ……………………………………………………………………….. 56
2.2.7. Khống chế sai số …………………………………………………………………. 58
2.3. Đạo đức nghiên cứu……………………………………………………………………… 58
2.4. Sơ đồ nghiên cứu …………………………………………………………………………. 59
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………………………….60
3.1. Kết quả điều trị loét hành tá tràng có Helicobacter pylori dương tính bằng
phác đồ EAC ……………………………………………………………………………….. 60
3.1.1. Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu …………………………………….. 60
3.1.2. Triệu chứng lâm sàng và đặc điểm nội soi trước điều trị………….. 61
3.1.3. Đặc điểm mức độ nhiễm H. pylori trên mô bệnh học ……………….. 62
3.1.4. Tỷ lệ kháng kháng sinh Clarithromycin và Amoxycillin của H. pylori. 62
3.1.5. Kết quả điều trị của phác đồ EAC………………………………………….. 63
3.1.6. Đánh giá tác dụng không mong muốn của phác đồ điều trị……….. 68
3.1.7. Ảnh hưởng của kháng Clarithromycin và Amoxicillin tới hiệu quả
điều trị của phác đồ EAC ………………………………………………………………. 68
3.2. Tình trạng tái phát và tái nhiễm H. pylori sau điều trị ………………………. 71
3.2.1. Sơ đồ về tình trạng tái xuất hiện H. pylori và tái phát ổ loét sau điều
trị tiệt trừ H. pylori ……………………………………………………………………….. 71
3.2.2. Đặc điểm tái phát và tái nhiễm H. pylori sau điều trị tiệt trừ của
nhóm nghiên cứu………………………………………………………………………….. 73
3.2.3. Kết quả sinh PCR-RFLP và giải trình tự gen UreC của các chủng
H. pylori nhiễm trước và sau điều trị tiệt trừ…………………………………….. 763.2.4. Minh họa kết quả sinh học phân tử so sánh chủng H. pylori trước và
sau điều trị tiệt trừ. ……………………………………………………………………….. 90
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN………………………………………………………………………………..95
4.1. Phân tích tỷ lệ kháng Amoxicillin, Clarithromycin và hiệu quả phác đồ
Esomeprazole-Amoxicilin-Clarithromycin (EAC) trên bệnh nhân loét tá
tràng có Helicobacter pylori dương tính ………………………………………….. 95
4.1.1. Đặc điểm nhóm nghiên cứu ………………………………………………….. 95
4.1.2. Triệu chứng lâm sàng…………………………………………………………… 96
4.1.3. Kích thước, số lượng và vị trí ổ loét dạ dày, tá tràng………………… 97
4.1.4. Tỷ lệ kháng kháng sinh Clarithromycin và Amoxicillin của H. pylori . 98
4.1.5. Kết quả điều trị của phác đồ EAC trong điều trị loét tá tràng…… 100
4.1.6. Ảnh hưởng của kháng kháng sinh đối với hiệu quả điều trị của phác
đồ EAC……………………………………………………………………………………… 108
4.2. Xác định tình trạng tái phát hay tái nhiễm Helicobacter pylori sau điều trị
tiệt trừ thành công, bằng kỹ thuật PCR-RFLP và PCR giải trình tự xác
định gen UreC ……………………………………………………………………………. 112
4.2.1. Tỷ lệ tái xuất hiện H. pylori sau điều trị tiệt trừ thành công …….. 112
4.2.2. Tỷ lệ tái phát ổ loét tá tràng…………………………………………………. 115
4.2.3. Kết quả phân biệt tái phát và tái nhiễm H. pylori sau điều trị tiệt trừ
H. pylori thành công……………………………………………………………………. 116
4.3. Hạn chế của nghiên cứu………………………………………………………………. 126
KẾT LUẬN……………………………………………………………………………………………………..128
KIẾN NGHỊ…………………………………………………………………………………………………….130
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ
ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN…………………………………….131
TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………………………………………………………..133
PHỤ LỤC

DANH MỤC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ
Biểu đồ Tên biểu đồ Trang
Biểu đồ 3.1. Phân bố bệnh nhân theo giới……………………………………………… 60
Biểu đồ 3.2. Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi…………………………………….. 61
Biểu đồ 3.3. Phân tích Kapplan-Meier của tỷ lệ bệnh nhân tái xuất hiện H.
pylori sau tiệt trừ thành công………………………………………….. 75
Biểu đồ 3.4. Tỷ lệ tái phát và tái nhiễm H. pylori sau điều trị tiệt trừ …….. 77
Sơ đồ 1.1. Cơ chế gây loét tá tràng của H. pylori …………………………………… 17
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ chọn mẫu nghiên cứu …………………………………………………. 43
Sơ đồ 3.1. Tái xuất hiện H. pylori sau điều trị tiệt trừ……………………………… 71
Sơ đồ 3.2. Tái phát ổ loét sau điều trị tiệt trừ …………………………………………. 72

DANH MỤC HÌNH
Hình Tên hình Trang
Hình1.1. Hình thái của H. pylori………………………………………………………………………..4
Hình 1.2. Tỷ lệ nhiễm H. pylori trong quần thể cư dân trên toàn thế giới ……….6
Hình 1.3. Nội soi dạ dày bằng ánh sáng thường ……………………………………………….9
Hình 1.4. Nội soi dạ dày phóng đại ……………………………………………………………………9
Hình 1.5. Ổ loét hành tá tràng…………………………………………………………………………..15
Hình 1.6. Tỷ lệ tái xuất hiện H. pylori toàn cầu………………………………………………..23
Hình 1.7. Thay đổi hình thái H. pylori từ hình que, hình V, hình U sang
hình cầu…………………………………………………………………………………………….26
Hình 1.8. Hình ảnh mô phỏng màng sinh học của H. pylori…………………………..27
Hình 1.9. Kết quả PCR-RFLP của sản phẩm khuếch đại gen UreC từ 12
chủng vi khuẩn H. pylori ………………………………………………………………….33
Hình 1.10 . So sánh thang điện di và các đỉnh sóng huỳnh quang ………………….35
Hình 2.1. Hình ảnh kết quả Urease test ……………………………………………………………45
Hình 2.2. Các vật liệu dùng để nuôi cấy H. pylori…………………………………………….47
Hình 2.3. Hình ảnh khuẩn lạc H. pylori …………………………………………………………..47
Hình 2.4. Đĩa kháng sinh đồ với Amoxicillin và Clarithromycin sử dụng Etest………………………………………………………………………………………………………53
Hình 2.5. Máy PCR……………………………………………………………………………………………55
Hình 2.6. Bộ điện di …………………………………………………………………………………………..55
Hình 2.7. Máy giải trình tự………………………………………………………………………………..56
Hình 2.8. Sơ đồ nghiên cứu ………………………………………………………………………………60
Hình 3.1. Thang DNA chuẩn dùng trong phân tích sản phẩm của PCR từ
bệnh phẩm sinh thiết dạ dày……………………………………………………………..79
Hình 3.2. Minh họa hình ảnh PCR gen UreC 820 bp của mã số bệnh
phẩm từ 1 đến 7…………………………………………………………………………………80
Hình 3.3. Kết quả sản phẩm PCR sau khi được cắt với enzym cắt giới hạn
Hha I (H)…………………………………………………………………………………………..80
Hình 3.4. Sản phẩm PCR-RFLP của mẫu bệnh phẩm từ 1 đến 6…………………..81Hình 3.5. Sản phẩm PCR-RFLP của mẫu bệnh phẩm từ 7 đến 12…………………82
Hình 3.6. Sản phẩm PCR-RFLP của mẫu bệnh phẩm từ 13 đến 18……………….83
Hình 3.7. Hình ảnh PCR gen UreC 820 bp……………………………………………………..90
Hình 3.8. Phân tích PCR khuếch đại đoạn DNA 820cặp bazơ từ mảnh
sinh thiết với enzym cắt giới hạn Hha I (H)……………………………………..90
Hình 3.9. Phân tích PCR khuếch đại đoạn DNA 820cặp bazơ từ mảnh
sinh thiết với các enzym cắt giới hạn Mbo I (M)………………………………90
Hình 3.10. Phân tích PCR khuếch đại đoạn DNA 820cặp bazơ từ mảnh
sinh thiết với các enzym cắt giới hạn Hind III (Hn) ………………………..91
Hình 3.11. Trình tự 712bp gen UreC của chủng H. pylori trước điều trị……….91
Hình 3.12. Sắc phổ một đoạn trình tự gen UreC của chủng H. pylori
trước điều trị ……………………………………………………………………………………..91
Hình 3.13. Trình tự 712bp gen UreC của chủng H. pylori sau điều trị…………..92
Hình 3.14. Sắc phổ một đoạn trình tự gen UreC của chủng H. pylori sau
điều trị………………………………………………………………………………………………..92
Hình 3.15. So sánh trình tự hai chủng H.pylori trước và sau điều trị……………..9