Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới để sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể trước làm tổ

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới để sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể trước làm tổ.Hiện nay, trên toàn thế giới có hơn 70 triệu cặp vợ chồng bị vô sinh [1].  ô sinh đã để lại hậu quả nặng nề về mọi mặt, đặc biệt trong nhiều nền văn hóa, phụ nữ được khẳng định giá trị thông qua việc làm mẹ, nên việc không thể thụ thai tạo ra nhiều gánh nặng về tâm lý, xã hội và kinh tế cho các gia đình nhất là đối với phụ nữ [2],[3],[4]. Nhờ sự phát triển của nền y học hiện đại, nhiều nguyên nhân vô sinh được tìm ra, từ đó đưa ra những phương pháp điều trị vô sinh phù hợp. Trong đó phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro fertilization/IVF) là một phương pháp hỗ trợ sinh sản có vai trò quan trọng trong điều trị vô sinh, và ngày càng được phát triển rộng khắp trên thế giới. Nhưng tỷ lệ thành công của IVF còn thấp vẫn chỉ từ 33-50% [5], mặc dù các phôi được chuyển là phôi đã được chọn lựa hình thái tốt. Tuy nhiên, không phải tất cả phôi I F hình thái bình thường đều có bộ nhiễm sắc thể (NST) bình thường. Các nhà nghiên cứu chỉ ra rằng rối loạn NST cao ở phôi là nguyên nhân chính làm tỷ lệ thành công IVF còn thấp [6].

Nhiều nghiên cứu đã thấy phôi người ở giai đoạn sớm thường có rối loạn NST [7],[8],[9] và trên 50% phôi tạo ra trong ống nghiệm có chứa phôi bào bị đột biến NST [10],[11],[12], tỷ lệ này tăng lên đáng kể khi người phụ nữ trên 35 tuổi [13]. Rối loạn về NST dẫn đến kết quả như phôi không làm tổ được, sẩy thai và hoặc thai chết lưu, hoặc sinh ra những đứa trẻ bị lệch bội NST.
Nghiên cứu của Jacobs đã chứng minh rằng các trường hợp sẩy thai tự nhiên trong ba tháng đầu có >50% có liên quan đến bất thường NST [14], theo Kline chỉ có khoảng 3% các trường hợp lệch bội mang thai được phát hiện lâm sàng còn >90% bị sẩy thai tự nhiên [15]. Những đứa trẻ lệch bội ra đời là gánh nặng tâm lí, kinh tế cho cả gia đình và xã hội vì trẻ thường tử vong sớm, thời gian nằm viện lâu, chi trả viện phí nhiều (tăng 184% theo Yoon và cộng sự) [16],[17].2
Vì vậy, việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền hiện đại nhằm phát hiện các rối loạn di truyền cho phôi trước làm tổ (Preimplantation genetic testing/PGT) là việc hết sức cần thiết. Vì PGT không những giúp giảm nguy cơ làm tổ thất bại và phá thai dị tật trên lâm sàng mà còn giúp sinh ra các em bé khỏe mạnh [18],[19],[20],[21].
Nhờ sự tiến bộ của di truyền học hiện đại, nhiều kỹ thuật di truyền tế bào và phân tử được ứng dụng thành công trong xét nghiệm di truyền trước làm tổ như FISH, CGH, aCGH, QF-PCR, BoBs, hoặc gần đây hơn là giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation Sequencing/NGS), mỗi kỹ thuật đều có ưu và nhược điểm khác nhau nên việc nghiên cứu tìm ra một kỹ thuật ưu việt để sàng lọc, lựa chọn phôi tốt có bộ NST bình thường là yêu cầu cấp thiết và thực tiễn, giúp cho I F đạt kết quả cao đảm bảo cho ra đời một thế hệ khoẻ mạnh về thể lực, sáng suốt về tinh thần, góp phần nâng cao chất lượng dân số.
Trong những năm gần đây, kỹ thuật NGS đã được áp dụng rộng rãi ở Châu Âu và được chứng minh là có giá trị hơn kỹ thuật FISH, aCGH trong việc phát hiện rối loạn NST của phôi [22],[23],[24],[25]. ì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: ‘‘Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới để sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể trước làm tổ” với 3 mục tiêu sau:
1. Hoàn thiện quy trình sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) trên tế bào phôi.
2. Đánh giá độ chính xác của kỹ thuật NGS so với kỹ thuật aCGH trong sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể trên tế bào phôi.
3. Đánh giá bước đầu kết quả sàng lọc phôi trước làm tổ bằng kỹ thuật NGS

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………………………………….. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN………………………………………………………………… 3
1.1. Tình hình vô sinh trên thế giới và tại Việt Nam ………………………………. 3
1.1.1. Khái niệm vô sinh ………………………………………………………………….. 3
1.1.2. Tình hình vô sinh trên Thế giới và Việt Nam…………………………….. 3
1.1.3. Điều trị vô sinh ……………………………………………………………………… 4
1.2. Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) ……………………………….. 5
1.2.1. Khái niệm……………………………………………………………………………… 5
1.2.2. Chỉ định………………………………………………………………………………… 5
1.2.3. Quy trình kỹ thuật IVF……………………………………………………………. 6
1.2.3.1. Chuẩn bị noãn………………………………………………………………….. 6
1.2.3.2. Cho noãn thụ tinh với tinh trùng trong phòng thí nghiệm………. 6
1.2.3.3. Chọn lựa phôi ………………………………………………………………… 14
1.2.3.4. Chuyển phôi vào buồng tử cung và theo dõi kết quả …………… 17
1.3. Các xét nghiệm di truyền trước làm tổ …………………………………………. 18
1.3.1. PGT-A………………………………………………………………………………… 18
1.3.2. PGT-SR………………………………………………………………………………. 19
1.3.3. PGT-M ……………………………………………………………………………….. 20
1.4. Kỹ thuật sinh thiết phôi………………………………………………………………. 21
1.4.1. Quy trình sinh thiết phôi ……………………………………………………….. 21
1.4.2. Thời điểm sinh thiết phôi………………………………………………………. 22
1.5. Các kỹ thuật di truyền ứng dụng trong xét nghiệm di truyền trước làm tổ… 25
1.5.1. Kỹ thuật lai huỳnh quanh tại chỗ (FISH) ………………………………… 25
1.5.2. Kỹ thuật lai so sánh hệ gen (CGH)…………………………………………. 26
1.5.3. Kỹ thuật lai so sánh hệ gen kết hợp microarray (aCGH) …………… 271.5.3.1. Nguyên lý hoạt động……………………………………………………….. 27
1.5.3.2. Quy trình hoạt động………………………………………………………… 29
1.5.3.3. Ứng dụng aCGH trong sàng lọc phôi………………………………… 30
1.5.4. Kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) ……………………………. 33
1.5.4.1. Khái niệm và nguyên lí hoạt động…………………………………….. 33
1.5.4.2. Quy trình hoạt động kỹ thuật NGS……………………………………. 34
1.6. Tình hình ứng dụng kỹ thuật NGS trong PGT trên thế giới và Việt Nam 35
1.7. Tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể của noãn và phôi ………………………………. 39
1.7.1. Tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể ở noãn ……………………………………….. 39
1.7.2. Tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể ở tiền nhân …………………………………. 39
1.7.3. Tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể ở phôi ngày 3 ……………………………… 40
1.7.4. Tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể ở phôi nang ………………………………… 41
1.7.5. Tỷ lệ phôi thể khảm ……………………………………………………………… 42
1.7.6. Hiện tượng tự sửa chữa của phôi lệch bội nhiễm sắc thể ngày 3 … 43
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 45
2.1. Đối tượng nghiên cứu ………………………………………………………………… 45
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn……………………………………………………………… 45
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ……………………………………………………………….. 45
2.2. Địa điểm nghiên cứu………………………………………………………………….. 45
2.3. Thời gian nghiên cứu …………………………………………………………………. 46
2.4. Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………………………. 46
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu ……………………………………………………………… 46
2.4.2. Cỡ mẫu nghiên cứu………………………………………………………………. 46
2.4.3. Các định nghĩa được dùng trong nghiên cứu……………………………. 47
2.4.4. Các biến số trong nghiên cứu ………………………………………………… 48
2.4.5. Các thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu……………………. 51
2.4.6. Quy trình nghiên cứu ……………………………………………………………. 532.4.7. Sơ đồ nghiên cứu …………………………………………………………………. 69
2.5. Phương pháp xử lí số liệu …………………………………………………………… 70
2.6. Sai số và khống chế sai số…………………………………………………………… 72
2.7. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu ………………………………………………… 72
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU …………………………………………… 73
3.1. Hoàn thiện quy trình sàng lọc rối loạn 24 NST bằng kỹ thuật NGS trên
tế bào phôi IVF ……………………………………………………………………………….. 73
3.1.1. Kết quả quy trình khuếch đại hệ gen từ tế bào phôi………………….. 73
3.1.2. Kết quả quy trình giải trình tự gen bằng NGS………………………….. 75
3.1.3. Kết quả quá trình tối ưu quy trình giải trình tự gen bằng các kit
chạy mẫu nhỏ ……………………………………………………………………………….. 79
3.2. Đánh giá độ chính xác của kỹ thuật NGS so với kỹ thuật aCGH trong
sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể trên tế bào phôi………………………………. 87
3.2.1. Kết quả định lượng DNA………………………………………………………. 87
3.2.2. Kết quả xét nghiệm của kỹ thuật NGS và kỹ thuật aCGH …………. 88
3.2.3. Đánh giá độ chính xác của NGS…………………………………………….. 93
3.3. Đánh giá kết quả sàng lọc phôi trước làm tổ bằng kỹ thuật NGS …….. 97
3.3.1. Đặc điểm bệnh nhân hiến phôi ………………………………………………. 97
3.3.2. Đặc điểm bất thường NST của phôi ……………………………………….. 98
3.3.3. Mối liên quan giữa tuổi mẹ và tình trạng phôi ……………………….. 102
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN……………………………………………………………….. 106
4.1. Hoàn thiện quy trình sàng lọc rối loạn 24 NST bằng kỹ thuật NGS
trên tế bào phôi ……………………………………………………………………………… 107
4.1.1. Quy trình khuếch đại hệ gen (WGA) …………………………………… 109
4.1.2. Quy trình giải trình tự gen ………………………………………………….. 112
4.2. Đánh giá độ chính xác của kỹ thuật NGS so với kỹ thuật aCGH trong
sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể trên tế bào phôi …………………………… 1154.3. Đánh giá kết quả sàng lọc phôi trước làm tổ bằng kỹ thuật NGS …. 120
4.3.1. Đặc điểm rối loạn của phôi …………………………………………………. 120
4.3.2. Tính ứng dụng của kỹ thuật NGS ………………………………………… 120
4.3.2. Mối liên quan giữa tuổi mẹ và tình trạng phôi………………………. 129
KẾT LUẬN …………………………………………………………………………………….. 134
KIẾN NGHỊ
NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA NGHIÊN CỨU
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN
QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Đồng thuận về hệ thống đánh giá tiền nhân của tổ chức Alpha …. 14
Bảng 1.2. Đồng thuận về hệ thống đánh giá phôi ở giai đoạn phân chia ……. 15
của tổ chức Alpha ………………………………………………………………………………. 15
Bảng 2.1. Các biến số thông tin chung của bệnh nhân hiến phôi ………………. 48
Bảng 2.2. Các biến số của mục tiêu 1 ……………………………………………………. 49
Bảng 2.3. Các biến số của mục tiêu 2 ……………………………………………………. 50
Bảng 2.4. Các biến số của mục tiêu 3 ……………………………………………………. 51
Bảng 2.5. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu………………………………………….. 52
Bảng 2.6. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu………………………………………… 52
Bảng 2.7. Tiêu chí đánh giá kết quả điện di……………………………………………. 55
Bảng 2.8. Tiêu chí đánh giá kết quả nồng độ DNA…………………………………. 56
Bảng 2.9. Các tiêu chí đánh giá chất lượng sản phẩm giải trình tự gen theo
yêu cầu của hãng ………………………………………………………………………………… 59
Bảng 2.10. Các bộ kit chạy máy để tối ưu quy trình giải trình tự gen………… 63
Bảng 3.1. Đánh giá kết quả điện di……………………………………………………….. 74
Bảng 3.2. Nồng độ DNA đo bằng Qubit………………………………………………… 74
Bảng 3.3. Đánh giá chất lượng nồng độ DNA sau WGA 24 mẫu……………… 75
Bảng 3.4. Đánh giá chất lượng kết quả giải trình tự gen ………………………….. 76
Bảng 3.5. Kết quả giải trình tự gen cho 24 mẫu ……………………………………… 77
Bảng 3.6. Đánh giá chất lượng kết quả giải trình tự gen bằng bộ kit Miseq
Reagent kit v2 Nano……………………………………………………………………………. 79
Bảng 3.7. Đánh giá chất lượng kết quả giải trình tự gen bằng bộ kit Miseq
Reagent kit v2 Micro…………………………………………………………………………… 81
Bảng 3.8. Đánh giá chất lượng kết quả giải trình tự gen bằng bộ kit Miseq
Reagent kit v2 Standard ………………………………………………………………………. 83Bảng 3.9. Đánh giá chất lượng kết quả giải trình tự gen bằng bộ kit Miseq
Reagent kit V3……………………………………………………………………………………. 85
Bảng 3.10. Nồng độ DNA đo bằng Qubit………………………………………………. 87
Bảng 3.11. Đánh giá chất lượng nồng độ DNA sau WGA 52 mẫu……………. 87
Bảng 3.12. Kết luận kết quả bằng NGS và aCGH…………………………………… 88
Bảng 3.13a. So sánh sự tương đồng về kết luận kết quả của kỹ thuật NGS… 93
và kỹ thuật aCGH ở 48 phôi…………………………………………………………………. 93
Bảng 3.13b. Đánh giá độ chính xác của kỹ thuật NGS…………………………….. 94
Bảng 3.14. Đặc điểm bệnh nhân …………………………………………………………… 97
Bảng 3.15. Đặc điểm vô sinh của bệnh nhân………………………………………….. 97
Bảng 3.16. Số lượng NST bị bất thường ở phôi ……………………………………… 99
Bảng 3.17. Tần suất bất thường của 24 NST ………………………………………… 101
Bảng 3.18. Đặc điểm phân bố tuổi và mối liên quan với số phôi…………….. 102
Bảng 3.19. Mối liên quan giữa tuổi và đặc điểm phôi……………………………. 102
Bảng 3.20. Mối liên quan giữa tuổi và các loại bất thường phôi……………… 103
Bảng 3.21. Mối liên quan giữa tuổi và mức độ rối loạn NST………………….. 103
Bảng 3.22. Liên quan giữa tuổi và tỷ lệ bất thường NST 13, 18, 21,……….. 104
và NST giới tính……………………………………………………………………………….. 10