Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification để chẩn đoán đột biến mất đoạn gen α globin gây bệnh α thalassemia
Luận án Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification để chẩn đoán đột biến mất đoạn gen α globin gây bệnh α thalassemia.Trong cơ thể con người, máu là thành phần có vai trò rất quan trọng. Máu có chức năng dinh dưỡng, hô hấp, bảo vệ, đào thải các sản phẩm chuyển hóa, tham gia điều hòa thân nhiệt, điều hòa hoạt động các cơ quan nhờ hệ thống hormone và enzyme. Máu có vai trò quan trọng như thế đối với sự sống nhưng cũng có nhiều căn bệnh liên quan đến máu như ung thư máu, thiếu máu hồng cầu hình liềm, máu khó đông,…Những căn bệnh này ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, cuộc sống con người, đặc biệt là những người có hoàn cảnh khó khăn về kinh tế, chi phí cho việc điều trị cao đã trở thành gánh nặng cho gia đình họ.
Trong số những căn bệnh về máu thì bệnh thiếu máu α thalassemia là một căn bệnh thiếu máu tan máu do di truyền khá phổ biến, đây là rối loạn di truyền đơn gen thường gặp nhất, bệnh di truyền theo quy luật alen lặn trên nhiễm sắc thể thường. Bệnh α thalassemiađược phát hiện ở 60 nước, tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ở vùng Địa Trung Hải, vùng Bắc và Tây Phi, Trung Đông, Nam Á và Đông Nam Á. Mỗi năm, trên thế giới có khoảng 100.000 em bé sinh ra mắc bệnh. Các nhà khoa học tiên đoán thalassemia sẽ trở thành bệnh lý toàn cầu. Cơ chế gây bệnh là do đột biến gen α globin nằm trên cánh ngắn NST 16 quy định, đột biến gengây giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi α globin, ảnh hưởng đến sự tổng hợp hemoglobin [5],[41], [50]. Hemoglobin là protein của hồng cầu, có chức năng vận chuyển oxy cho cơ và máu. Hemoglobin là phân tử tetramer chứa bốn chuỗi globin (bản chất là polypeptid) và bốn nhóm ngoại hem, mỗi chuỗi globin kết hợp với một hem tạo một tiểu đơn vị của hemoglobin. Mọi hemoglobin bình thường được hình thành từ hai chuỗi α globin liên kết với hai chuỗi “không α” globin. Ở người trưởng thành, dạng phổ biến nhất của hemoglobin là HbA1, gồm tổ hợp của 2 chuỗi α globin (141 acid amin) và 2 chuỗi β globin (146 acid amin) gọi là dạng α2β2. Máu người trưởng thành còn chứa một lượng ít HbA2 (khoảng 2%) là sự tổ hợp của 2 chuỗi α globin và 2 chuỗi δ globin gọi là dạng α2δ2 [59]. Bệnh αthalassemia là rối loạn di truyền do đột biến gen α globin, dẫn đến giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi α globin, trong khi đó quá trình tổng hợp chuỗi β globin vẫn diễn ra bình thường. Bình thường 2 loại chuỗi α globin và β globin cặp đôi với nhau theo tỷ lệ 1:1, như vậy bệnh nhân α thalassemia sẽ có sự mất cân bằng giữa các chuỗi globin. Loại chuỗi β globin được tổng hợp bình thường trở nên dư thừa vì không được cặp đôi, sẽ tích tụ trong tế bào hồng cầu và gây phá hủy hồng cầu [59]. 7
Khi xã hội ngày càng phát triển thì có nhiều thành tựu mới được áp dụng trong y học để tìm nguyên nhân và phương pháp điều trị hiệu quả nhằm cải thiện sức khỏe cho bệnh nhân. Phát hiện đột biến gen gây bệnh có ý nghĩa rất lớn đối với điều trị cũng như giúp chẩn đoán trước sinh và tư vấn di truyền. Phát hiện sớm bệnh α thalassemia có thể giúp điều trịsớm, tránh các biến chứng của bệnh và nguy cơ tử vong. Đột biến gây bệnh α thalassemiathường gặp là đột biến mất đoạn gen α globin nên các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để xác định đột biến ở bệnh nhân α thalassemia là kỹ thuật đơn PCR, multiplex PCR, HPLC,…[17], [18], [24], [45], [53], [61].
Gần đây, kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) ra đời và được áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán mất đoạn và lặp đoạn gen nói chung hay bệnh αthalassemia nói riêng. Kỹ thuật MLPA có ưu điểm là dễ thực hiện, cho kết quả nhanh và có độ chính xác cao [10]. Từ những ý nghĩa của việc phát hiện ra các đột biến gen gây bệnh αthalassemia và mong muốn đưa một kỹ thuật sinh học phân tử khá mới vào việc xác định các đột biến gen α globin ở Việt Nam nên chúng tôi đã chọn và thực hiện đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification để chẩn đoán đột biến mất đoạn gen α globin gây bệnh α thalassemia”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
1. Ứng dụng kỹ thuật MLPA giúp chẩn đoán đột biến mất đoạn gen α globin gây bệnh α thalassemia.
2. Xác định các kiểu đột biến mất đoạn gen α globin thường gặp trên bệnh nhân αthalassemia ở Việt Nam và tỷ lệ của các kiểu đột biến đó.
3. Nội dung nghiên cứu
– Tiến hành các bước của kỹ thuật MLPA giúp chẩn đoán đột biến mất đoạn gen α
globin trên các mẫu bệnh nhân đã được chẩn đoán mắc bệnh α thalassemia dựa vào triệu
chứng lâm sàng, cận lâm sàng.
– Xác định các kiểu đột biến gen α globin trong các mẫu nghiên cứu và tỷ lệ của chúng, căn cứ vào các tỷ lệ đó để xác định các dạng đột biến mất đoạn gen α globin thường gặp ở Việt Nam.
4. Phạm vi nghiên cứu 8
Do hạn chế về thời gian, kinh phí nghiên cứu cũng như để có thể hoàn thành luận văn được tốt trong khả năng kiến thức, nên đề tài này chỉ nghiên cứu về việc ứng dụng kỹ thuật MLPA để chẩn đoán đột biến mất đoạn gen α globin gây bệnh α thalassemia và xác định các kiểu đột biến gen α globin thường gặp ở Việt Nam.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận vănBệnh thiếu máu là một trong những căn bệnh ảnh hưởng lớn đến sức khỏe cũng như cuộc sống của con người. Bệnh α thalassemia là một trong số những căn bệnh thiếu máu đang được chú ý nghiên cứu và sử dụng các biện pháp, kỹ thuật khác nhau để chẩn đoán, phát hiện người mang gen đột biến đặc biệt là những người mang đột biến ở thể ẩn, thể nhẹ(chỉ mất một, hai gen), tuy những người này không biểu hiện bệnh hoặc có biểu hiện rất nhẹnhưng họ có thể di truyền gen đột biến lại cho thế hệ sau và có thể gây ra bệnh nặng ở con cháu của họ với nhiều biến chứng nguy hiểm, thậm chí tử vong. Gen đột biến từ những người này có thể lan truyền trong cộng đồng, do vậy việc tìm hiểu, nghiên cứu, xác định các dạng đột biến ở bệnh nhân α thlassemia ở Việt Nam là rất ý nghĩa. Có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để xác định đột biến ở bệnh nhân α thalassemia nhưng gần đây kỹthuật MLPA ra đời với nhiều ưu điểm và được áp dụng rộng rãi ở các nước phát triển. ỞViệt Nam, việc ứng dụng kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán di truyền bệnh α thalassemia vẫn còn hạn chế. Việc ứng dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán đột biến mất đoạn gen α globin không chỉ có ý nghĩa rất lớn trong việc mang lại kết quả nhanh chóng, chính xác mà còn giúp chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân. Việc xác định các kiểu đột biến gen α globin thường gặp ở Việt Nam giúp cho chúng ta có cái nhìn bao quát về tình hình bệnh αthalassemia tại nước ta, để có những dẫn chứng, dữ liệu cho các nghiên cứu tiếp theo cũng như giúp ích cho việc dự báo, chẩn đoán, phát hiện sớm và điều trị được chính xác, hiệu quả hơn, phát hiện các đột biến trên vùng gen α globin là cơ sở vững chắc cho chẩn đoán trước sinh bệnh α thalassemia
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ………………………………………………………………………………………….. 1
LỜI CẢM ƠN ……………………………………………………………………………………………….. 2
MỤC LỤC …………………………………………………………………………………………………….. 3
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ………………………………………………………………. 5
MỞ ĐẦU ……………………………………………………………………………………………………….. 6
1. Lý do chọn đề tài ………………………………………………………………………………………………. 6
2. Mục tiêu nghiên cứu …………………………………………………………………………………………. 7
3. Nội dung nghiên cứu …………………………………………………………………………………………. 7
4. Phạm vi nghiên cứu ………………………………………………………………………………………….. 7
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn ………………………………………………………. 8
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ………………………………………………………….. 9
1.1. Cấu tạo của hồng cầu …………………………………………………………………………………….. 9
1.1.1. Thành phần Hem ……………………………………………………………………………………….. 9
1.1.2. Thành phần globin ……………………………………………………………………………………. 10
1.2. Bệnh thalassemia và α thalassemia ……………………………………………………………….. 11
1.2.1. Bệnh thalassemia ……………………………………………………………………………………… 11
1.2.2. Bệnh α thalassemia …………………………………………………………………………………… 12
1.2.3. Các phương pháp sinh học phân tử xác định đột biến gen HBA …………………….. 20
1.2.4. Hướng điều trị bệnh α thalassemia ……………………………………………………………… 25
1.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật MLPA và đột biến gen α globin gây
bệnh α thalassemia ……………………………………………………………………………………………… 26
1.3.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài ……………………………………………………………. 27
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước …………………………………………………………….. 29
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………… 31
2.1. Đối tượng nghiên cứu …………………………………………………………………………………… 31
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu …………………………………………………………………. 31
2.3. Các thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu ………………………………………………… 31
2.3.1. Các thiết bị, dụng cụ …………………………………………………………………………………. 31
2.3.2. Hóa chất ………………………………………………………………………………………………….. 31
2.4. Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………………………………………… 32
2.4.1. Tách chiết DNA từ mẫu máu ngoại vi ………………………………………………………… 32
2.4.2. Đo nồng độ và độ tinh sạch DNA ………………………………………………………………. 34
4
2.4.3. Tiến hành kỹ thuật MLPA …………………………………………………………………………. 35
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN …………………………………………………….. 40
3.1. Kết quả hiệu chỉnh tín hiệu khuếch đại của các đoạn dò đặc hiệu ………………….. 40
3.2. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu ………………………………………………………………. 42
3.3. Kết quả xác định đột biến của bệnh nhân và bàn luận các kết quả …………………. 43
3.3.1. Kết quả xác định đột biến mất đoạn gen α globin …………………………………………. 43
3.3.2. Kết quả của các mẫu bệnh nhân có đột biến mất đoạn dạng–SEA
……………………. 46
3.3.3. Kết quả của các mẫu bệnh nhân có đột biến mất đoạn dạng -α
3,7
……………………. 49
3.3.4. Kết quả của các mẫu bệnh nhân có đột biến mất đoạn dạng -α
4,2
……………………. 52
3.3.5. Kết quả của các mẫu bệnh nhân không có đột biến mất đoạn ………………………… 54
3.3.6. Tỷ lệ đột biến mất đoạn ở bệnh nhân α thalassemia ……………………………………… 56
3.3.7. Sự phân bố vị trí bị mất đoạn của gen α thalassemia …………………………………….. 57
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………………………………….. 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………………………………………………………. 61
PHỤ LỤC ……………………………………………………………………………………………………. 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Phạm Ngọc Dũng, Nguyễn Ngọc Rạng (2010), “Tần suất bệnh lý hemoglobin trên các bệnh nhân đến khám bệnh tại bệnh viện An Giang”, Kỷ yếu Hội nghị Khoa học, tr. 144-153.
2. Nguyễn Trí Dũng (2009), Mô học đại cương, Nxb Khoa học và kĩ thuật, tr. 118-121.
3. Lý Thị Thanh Hà, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Thị Phương Mai, Nguyễn Thị Tân Sinh, Dương Bá Trực, Bùi Văn Viên , Nguyễn Thanh Liêm (2010), “Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán trước và sau sinh bệnh α thalassemia tại Bệnh viện nhi Trung ương”, Tạp chí Nhi khoa, 3(3), tr. 337-342.
4. Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR và ứng dụng trong phân tích DNA, Nxb Khoa học tự nhiên và Công nghệ, tr. 241-249.
5. Tạ Thành Văn (2011), Bệnh học phân tử, Nxb Y Học, tr. 67-80
Hy vọng sẽ giúp ích cho các bạn, cũng như mở ra con đường nghiên cứu, tiếp cận được luồng thông tin hữu ích và chính xác nhất