Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình

Luận văn y học Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình.Hiện nay, một trong các vấn đề nóng bỏng về chăm sóc sức khỏe sinh sản mà các nƣớc trên thế giới đang đối mặt là bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục. Viêm đƣờng sinh dục do Chlamydia trachomatis đƣợc coi là bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục đứng đầu trên thế giới. Nhiễm Chlamydia trachomatis thƣờng gây viêm niệu đạo, viêm cổ tử cung. Tuy nhiên nếu không điều tri ̣có thể dâñ đến các biến chƣ́ ng nhƣ viêm phần phụ, đau vùng chậu mãn tính, thai ngoài tử cung, vô sinh do tổn thƣơng ống dẫn trứng, viêm mào tinh đòi hỏi phải chăm sóc y tế với phí tổn cao.

Tổ chức Y tế thế giới ƣớc tính hàng năm có khoảng 90 triệu ca nhiễm Chlamydia trachomatis đƣợc phát hiện mới [34]. Bệnh do Chlamydia trachomatis hay gặp ở những ngƣời trẻ tuổi, trong độ tuổi sinh đẻ.
Các nghiên cứu mới đây cho thấy, tỷ lệ mắc bệnh này đang tăng lên. Tại Châu Âu từ năm 1996-2003, số bệnh nhân nhiễm Chlamydia trachomatis đã tăng gấp đôi, tại Hoa Kỳ con số này cũng tăng 14% trong giai đoạn 2000-2005 [15, 18]. Ở Việt Nam trong khoảng vài năm gần đây vấn đề nhiễm khuẩn do Chlamydia trachomatis mới đƣợc chú ý. Một vài nghiên cứu đƣa ra tỷ lệ khoảng 30% các trƣờng
hợp đến khám phụ khoa có tiết dịch đƣờng âm đạo bất thƣờng là do Chlamydia trachomatis. Nguy hiểm nhất của nhiễm Chlamydia trachomatis qua đƣờng sinh dục là có tới 75% nữ giới và 50% nam giới mắc bệnh mà không có triệu chứng, ngƣời bệnhhoàn toàn không biết mình nhiễm vi khuẩn [2,9].
Để chẩn đoán nhiễm Chlamydia trachomatis ngƣời ta thƣờng dùng xét nghiệm nuôi cấy- tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán xác định nhiễm Chlamydia trachomatis. Tuy nhiên xét nghiệm này có hạn chế là phải bảo đảm vi khuẩn còn sống trong quá trình vận chuyển đến phòng xét nghiệm, thời gian xét nghiệm dài.
Khuếch đại acid nucleic (nucleic acid amplification tests – NAATs) là kỹ thuật sinh học phân tử đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong y học để phát hiện sự tồn tại của các vi sinh vật trong các mẫu bệnh phẩm. Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction– PCR) là một NAATs có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, nhiều nghiên cứu đã xem PCR là một tiêu chuẩn vàng để khảo sát giá trị của các xét nghiệm chẩn đoán2 khác. Đối với bệnh nhiễm Chlamydia trachomatis, xét nghiệm này cho phép xác định
sự tồn tại của vi khuẩn trong dịch âm đạo, tử cung của bệnh nhân. Với mong muốn đóng góp vào công tác chăm sóc sức khỏe nói chung và công tác chăm sóc sức khỏe sinh sản nói riêng, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình” với mục tiêu:
– Chuẩn hóa được quy trình kỹ thuật thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn Chlamydia trachomatis.
– Xác điṇ h được tỷ lê ̣nhiêm̃ Chlamydia trachomatis ở bệnh nhân viêm âm đạo, cổ tử cung

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU………………………………………………………………………………………………………….1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN……………………………………………………………………………..3
1.1. Vi khuẩn Chlamydia trachomatis………………………………………………………………..3
1.2. Các xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn Chlamydia trachomatis ………………………….6
1.2.1. Nuôi cấy ……………………………………………………………………………………………..6
1.2.2. Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (enzyme immunoassays – EIAs) ……………..7
1.2.3. Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang trực tiếp (direct fluorescent antibody – DFA)..8
1.2.4. Kỹ thuật khuếch đại acid nucleic (nucleic acid amplification tests – NAATs)…. 8
1.3. Các nghiên cứu về Chlamydia trachomatis trên thế giới và trong nƣớc………….10
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới ………………………………………………………………..10
1.3.2. Các nghiên cứu trong nƣớc ………………………………………………………………….18
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………………..23
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU …………………………………………………………………..23
2.1.1. Đối tƣơṇ g nghiên cƣ́ u …………………………………………………………………………23
2.1.2. Thời gian nghiên cứu. …………………………………………………………………………23
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu…………………………………………………………………………..23
2.2. PHƢƠNG PHÁ P NGHIÊN CƢ́ U ……………………………………………………………..23
2.2.1. Phƣơng pháp chọn mẫu và cỡ mâũ ……………………………………………………….23
2.2.2. Kỹ thuật xét nghiệm ……………………………………………………………………………24
2.2.2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu…………………………………………………………………….24
2.2.2.2. Xử lý mẫu…………………………………………………………………………………….24
2.2.2.3. Tách chiết ADN ……………………………………………………………………………25
2.2.2.4. Tối ƣu hóa phản ứng PCR………………………………………………………………25
2.2.2.5. Xác định độ nhạy của phản ứng PCR ………………………………………………29
2.2.2.6. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng …………………………………………………30
2.2.2.7. Xác điṇ h tỷ lê ̣nhiêm̃ Chlamydia trachomatis ở bệnh nhân viêm âm đạo ,
cổ tƣ̉ cung đến khám tại bệnh viện Đại học Y Thái Bình t ừ tháng 4 đến tháng 10
năm 2011 …………………………………………………………………………………………………31
2.2.2.8. Điêṇ di, phân tích kết quả ………………………………………………………………31
2.2.3. Xƣ̉ lý số liêụ ………………………………………………………………………………………3255
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………………………………………………………..33
3.1. Tối ƣu hóa phản ƣ́ ng PCR phát hiêṇ Chlamydia trachomatis………………………..33
3.1.1. Nồng độ MgCl2 ………………………………………………………………………………….33
3.1.2. Nồng độ mồi ……………………………………………………………………………………..35
3.1.3. Thời gian và nhiệt độ gắn mồi ……………………………………………………………..37
3.1.4. Số chu kỳ…………………………………………………………………………………………..40
3.2. Độ nhạy của kỹ thuật PCR………………………………………………………………………..43
3.3. Độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR…………………………………………………………………..44
3.4. Kết quả xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR ……………………………………………………..44
KẾT LUẬN ……………………………………………………………………………………………………49
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………………………………….5056
DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ
Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của vi khuẩn Chlamydia trachomatis………………………3
Hình 1.2. Chu kỳ vòng đời của vi khuẩn C.trachomatis………………………………..4
Hình 1.3. Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis ở một số nƣớc Châu Âu……………………10
Hình 3.1. Ảnh điện di kết quả tối ƣu nồng độ MgCl2 với cặp mồi KL1/KL2…….34
Hình 3.2. Ảnh điện di kết quả tối ƣu nồng độ MgCl2 với cặp mồi KL5/KL6…….35
Hình 3.3. Ảnh điện di kết quả tối ƣu nồng độ mồi KL5/KL6……………………..36
Hình 3.4. Ảnh điện di kết quả tối ƣu nồng độ mồi KL1/KL2……………………..36
Hình 3.5. Ảnh diện di kết quả tối ƣu nhiệt độ gắn mồi KL1/KL2…………………38
Hình 3.6. Ảnh diện di kết quả tối ƣu nhiệt độ gắn mồi KL5/KL6………………..38
Hình 3.7. Ảnh diện di kết quả tối ƣu thời gian gắn mồi KL5/KL6……………….39
Hình 3.8. Ảnh diện di kết quả tối ƣu thời gian gắn mồi KL1/KL2…………….….40
Hình 3.9. Ảnh diện di kết quả tối ƣu chu kỳ phản ứng……………………………40
Hình 3.10. Ảnh diện di độ nhạy phản ứng PCR hai lần trên vi khuẩn C. trachomatis……43
Hình 3.11. Kết quả xét nghiệm trên mẫu bệnh phẩm…………………………..…45
Bảng 3.1. Thành phần phản ứng PCR lần thứ nhất……………………………..…41
Bảng 3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR lần thứ nhất…………………….….42
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng PCR lần 2…………………………………….…42
Bảng 3.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR lần 2……………………………….43
Bảng 3.5. Kết quả xét nghiệm C.trachomatis…………………………………….45
Bảng 3.6. Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis theo độ tuổi………………………………..46
Bảng 3.7. Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis theo khu vực……………………………