Nghiên cứu ứng dụng và hoàn thiện quy trình thu gom, xử lý, bảo quản tế bào gốc tạo máu dùng cho ghép đồng loại

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu ứng dụng và hoàn thiện quy trình thu gom, xử lý, bảo quản tế bào gốc tạo máu dùng cho ghép đồng loại. Ghép tế bào gốc tạo máu là phương pháp điều trị hiện đại, có hiệu quả đối với các bệnh lý cơ quan tạo máu và một số bệnh lý khác. Nguồn tế bào để sử dụng cho ghép chủ yếu được thu gom từ tuỷ xương, từ máu ngoại vi sau khi kích thích và từ máu dây rốn.
Ghép tế bào gốc đồng loại (allograft) là quá trình truyền tế bào gốc từ người cho (có hoặc không có mối quan hệ huyết thống) nhằm tái lập khả năng tạo máu ở người bệnh. Phương pháp này thường được áp dụng trong những bệnh lý: Lơxêmi cấp dòng tuỷ, lơxêmi cấp dòng lympho, suy giảm miễn dịch nặng, suy tuỷ xương, bệnh lý huyết sắc tố, bệnh hồng cầu hình liềm…do mô tạo máu bị tổn thương nặng nề, không có khả năng tự hồi phục.

Quá trình ghép có thể được tiến hành sau điều trị làm giảm khối tế bào ung thư và tạo điều kiện cho các tế bào ghép có thể mọc được dễ dàng (quá trình điều kiện hoá). Thời gian mọc ghép và khả năng duy trì tạo máu dài hạn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó sự khác nhau về đặc điểm của các tế bào gốc tạo máu giữa các nguồn cung cấp có vai trò quan trọng.
Bên cạnh tác dụng hồi phục mô tạo máu, gần đây, hiệu quả hồi phục và duy trì khả năng miễn dịch của cơ thể nhận ghép đã được chứng minh và ứng dụng trên lâm sàng. Các tế bào có thẩm quyền miễn dịch, có trong chế phẩm tế bào gốc hoặc được biệt hóa từ các tế bào gốc của người cho, sau khi truyền vào cơ thể nhận là thành phần chủ yếu của phản ứng ghép chống chủ nhưng đồng thời là phản ứng ghép chống ung thư/lơxêmi. Các tế bào miễn dịch này sẽ “nhận diện” các tế bào ung thư của người bệnh và gây đáp ứng miễn dịch nhằm “diệt” các tế bào này. Kết quả của phản ứng ghép chống ung thư sẽ giúp kéo dài thời gian sống thêm không bệnh của người nhận ghép.
Từ những nguồn cung cấp chủ yếu, quá trình thu gom, xử lý và bảo quản các tế bào gốc đòi hỏi những quy trình kỹ thuật khác nhau. Hiệu quả thu được những chế phẩm tế bào gốc mang những đặc điểm sinh học cũng khác nhau không những về mặt thành phần, số lượng tế bào gốc tạo máu mà còn2
Hiện tại ở Việt Nam, phương pháp ghép tế bào gốc tạo máu đã được triển khai từ nhiều năm tại một số trung tâm trong cả nước, tuy nhiên các công trình nghiên cứu công bố về quy trình thu gom, xử lý và bảo quản dài hạn các mẫu tế bào gốc tạo máu từ các nguồn cung cấp chủ yếu còn ít và chưa hệ thống. Xuất phát từ thực tế này, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng và hoàn thiện quy trình thu gom, xử lý, bảo quản tế bào gốc tạo máu dùng cho ghép đồng loại” được tiến hành với các mục tiêu:
1. Ứng dụng và hoàn thiện quy trình thu gom, xử lý và bảo quản dài ngày tế bào gốc tạo máu từ máu ngoại vi, dịch tủy xương và máu dây rốn.
2. Đánh giá khả năng tạo cụm của tế bào gốc tạo máu và đặc điểm tế bào miễn dịch của các mẫu tế bào gốc từ máu ngoại vi, dịch tủy xương và máu dây rốn.

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Khái niệm và xếp loại tế bào gốc 3
1.1.1. Khái niệm về tế bào gốc 3
1.1.2. Xếp loại tế bào gốc 3
1.2. Tế bào gốc trong quá trình tạo máu 9
1.2.1. Đặc điểm tế bào gốc tạo máu 9
1.2.2. Nguồn gốc tế bào gốc tạo máu 10
1.2.3. Các phương pháp xác định tế bào gốc tạo máu 11
1.2.4. Ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc tạo máu 14
1.3. Nguồn cung cấp và thu gom tế bào gốc tạo máu 16
1.3.1. Tế bào gốc tạo máu sau huy động ra máu ngoại vi 17
1.3.2. Tế bào gốc tạo máu từ tủy xương 24
1.3.3. Tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn 25
1.3.4. Ứng dụng và lựa chọn các nguồn tế bào gốc tạo máu 26
1.4. Xử lý và bảo quản tế bào gốc tạo máu 28
1.4.1. Xử lý tế bào gốc tạo máu sau thu gom 29
1.4.2. Bảo quản tế bào gốc tạo máu 32
1.4.3. Đánh giá và kiểm tra chất lượng chế phẩm tế bào gốc 34
1.4.4. Ngân hàng tế bào gốc tạo máu 35
1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc tại Việt Nam 36Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Đối tượng nghiên cứu 39
2.1.1. Các mẫu tế bào gốc thu gom từ máu ngoại vi 39
2.1.2. Các mẫu tế bào gốc thu gom từ tủy xương 40
2.1.3. Các mẫu tế bào gốc thu gom từ máu dây rốn 41
2.2. Phương pháp nghiên cứu 43
2.2.1. Vật liệu nghiên cứu và trang thiết bị, sinh phẩm 43
2.2.2. Tiến hành nghiên cứu 47
2.2.3. Các biến số nghiên cứu 53
2.3. Địa điểm tiến hành nghiên cứu 54
2.4. Xử lý số liệu 54
2.5. Khía cạnh đạo đức của nghiên cứu 55
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả thu gom tế bào gốc tạo máu từ các nguồn khác nhau 56
3.1.1. Kết quả thu gom từ máu ngoại vi 56
3.1.2. Kết quả thu gom từ dịch hút tủy xương 71
3.1.3. Kết quả thu gom từ máu dây rốn 74
3.2. Kết quả xử lý các mẫu sản phẩm tế bào gốc tạo máu 80
3.2.1. Kết quả loại bỏ hồng cầu 80
3.2.2. Kết quả thu hồi tế bào CD34 sau xử lý 84
3.3. Kết quả nghiên cứu bảo quản tế bào gốc tạo máu ở – 196 0C 87
3.3.1. Số lượng tế bào có nhân sau rã đông 87
3.3.2. Tỷ lệ tế bào sống theo thời gian sau khi rã đông 87
3.4. Đặc điểm tế bào huyết học-miễn dịch và tế bào gốc tạo máu
của các sản phẩm từ các nguồn cung cấp khác nhau 89
3.4.1. Đặc điểm tế bào máu của các sản phẩm 89
3.4.2. Đặc điểm tế bào miễn dịch của các sản phẩm 91
3.4.3. Đặc điểm về tế bào gốc tạo máu của các sản phẩm 92Chương 4. BÀN LUẬN
4.1. Về quy trình và kết quả thu gom tế bào gốc tạo máu 95
4.1.1. Thu gom tế bào gốc từ máu ngoại vi không huy động 95
4.1.2. Thu gom tế bào gốc từ máu ngoại vi huy động bằng G-CSF 99
4.1.3. Thu gom tế bào gốc từ tủy xương 105
4.1.4. Thu gom tế bào gốc từ máu dây rốn 109
4.2. Về quy trình và kết quả xử lý các mẫu tế bào gốc tạo máu 115
4.2.1. Loại hồng cầu bằng phương pháp ly tâm đơn thuần 116
4.2.2. Loại hồng cầu có sử dụng dung dịch cao phân tử 117
4.2.3. Hiệu quả giảm thể tích mẫu và thu hồi tế bào gốc 120
4.3. Về quy trình và kết quả bảo quản tế bào gốc tạo máu 122
4.3.1. Quy trình bảo quản 122
4.3.2. Kết quả bảo quản và những biến đổi tế bào 123
4.4. Về đặc điểm huyết học, miễn dịch và khả năng tạo máu 125
4.4.1. Một số đặc điểm tế bào máu của các mẫu tế bào gốc 126
4.4.2. Một số đặc điểm tế bào miễn dịch của các mẫu tế bào gốc 128
4.4.3. Tế bào gốc và khả năng tạo máu của các mẫu tế bào gốc 131
KẾT LUẬN 136
KIẾN NGHỊ 138
ĐÓNG GÓP CỦA LUẬN ÁN
Danh mục các bài báo và công trình nghiên cứu
Tài liệu tham khảo
Phụ lục

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Thể tích và các chỉ số CD34 của các mẫu thu gom từ máu ngoại vi
không huy động
56
Bảng 3.2. Một số chỉ số huyết học của các mẫu thu gom từ máu ngoại vi
không huy động
57
Bảng 3.3. Một số chỉ số tế bào miễn dịch của các mẫu thu gom từ máu
ngoại vi không huy động
58
Bảng 3.4. Các chỉ số tế bào máu trước và sau tách không huy động 59
Bảng 3.5. Số lượng CD34 thu gom được từ máu ngoại vi sau huy động 62
Bảng 3.6. Hiệu quả thu gom tế bào CD34 sau huy động ra máu 63
Bảng 3.7. Thể tích và các chỉ số CD34 của các mẫu thu gom từ máu ngoại vi
không huy động
64
Bảng 3.8. Một số chỉ số tế bào máu của đơn vị tế bào thu gom từ máu ngoại
vi sau huy động (n= 10)
64
Bảng 3.9. Một số chỉ số tế bào miễn dịch trong đơn vị tế bào thu gom từ máu
ngoại vi sau huy động.
65
Bảng 3.10. Thay đổi các chỉ số tế bào máu trong quá trình huy động 66
Bảng 3.11. Mối tương quan giữa chỉ số CD34 huy động và các thành phần
bạch cầu máu ngoại vi
68
Bảng 3.12. Biểu hiện lâm sàng trong quá trình huy động và tách tế bào 70
Bảng 3.13. Các chỉ số đông máu trước và sau khi tách tế bào (n = 10) 70
Bảng 3.14. Các chỉ số hóa sinh trước và sau khi tách tế bào (n = 10) 71
Bảng 3.15. Số lượng tế bào có nhân và CD34 của mẫu tế bào thu gom từ tuỷ
xương
72
Bảng 3.16. Một số chỉ số tế bào máu của mẫu thu gom từ tuỷ xương. 72
Bảng 3.17. Số lượng và tỷ lệ % TB MD của mẫu thu gom từ tuỷ xương 73
Bảng 3.18. Thể tích và các chỉ số tế bào máu của máu dây rốn 74
Bảng 3.19. Phân bố thể tích mẫu máu dây rốn sau thu gom 75
Bảng 3.20. Số lượng bạch cầu đơn nhân và CD34 của mẫu máu dây rốn. 75Bảng 3.21. Một số chỉ số tế bào máu của mẫu máu dây rốn 76
Bảng 3.22. Một số chỉ số tế bào miễn dịch của mẫu máu dây rốn 77
Bảng 3.23. Một số chỉ số lâm sàng của mẹ và trẻ sơ sinh 78
Bảng 3.24. Liên quan giữa cân nặng trẻ và số lượng tế bào có nhân, tế bào
CD34 thu được từ máu dây rốn
79
Bảng 3.25. Kết quả xử lý mẫu TB gốc máu ngoại vi sau huy động (n=10) 80
Bảng 3.26. Kết quả xử lý mẫu dịch tủy bằng hai phương pháp 81
Bảng 3.27. Kết quả loại hồng cầu và bạch cầu của đơn vị máu dây rốn bằng ly
tâm
83
Bảng 3.28. Kết quả xử lý máu dây rốn có sử dụng HES 83
Bảng 3.29. Thể tích và số lượng TB có nhân của đơn vị máu dây rốn trước và
sau xử lý.
84
Bảng 3.30. Kết quả thu hồi CD34 sau xử lý loại huyết tương của mẫu tế bào 84
gốc máu ngoại vi sau huy động (n=10)
Bảng 3.31. Kết quả thu hồi CD34 sau xử lý mẫu dịch tủy xương (n = 10) 85
Bảng 3.32. Kết quả thu hồi tế bào CD34 sau xử lý MDR có sử dụng HES 85
Bảng 3.33. Tổng hợp kết quả thu hồi CD34 sau quá trình xử lý 85
Bảng 3.34. Tỷ lệ tế bào sống của các đơn vị tế bào gốc sau bảo quản. 87
Bảng 3.35. Đặc điểm tế bào máu từ các nguồn cung cấp tế bào gốc 89
Bảng 3.36. Thành phần bạch cầu của chế phẩm từ các nguồn cung cấp 90
Bảng 3.37. Các dưới nhóm lympho từ các nguồn cung cấp 91
Bảng 3.38. Các chỉ số CD34 từ các nguồn cung cấp 92
Bảng 3.39. Số lượng và loại cụm tế bào 92
Bảng 3.40. Khả năng tạo cụm của tế bào gốc từ các nguồn cung cấp 94
Bảng 4.1. So sánh thể tích thu gom máu dây rốn 111
Bảng 4.2. Kết quả xử lý mẫu máu dây rốn 119
Bảng 4.3. Hiệu quả thu hồi tế bào đơn nhân và CD34 máu dây rốn 12