Nghiên cứu xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát và phát hiện người lành mang gen bệnh
Nghiên cứu xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát và phát hiện người lành mang gen bệnh.Glôcôm bẩm sinh nguyên phát là tình trạng tăng nhãn áp do sự phát triển bất thường của bán phần trước nhãn cầu. Bệnh thường xảy ra ở hai mắt (65%-80%), phát hiện ở giai đoạn muộn, điều trị gặp tỷ lệ thất bại cao nếu không được điều trị kịp thời và theo dõi chặt chẽ. Đây là một trong những nguyên nhân gây mù lòa quan trọng ở trẻ nhỏ [1], [2], [3].
Glôcôm bẩm sinh nguyên phát là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường với tần suất mắc bệnh khoảng 1/10.000 [4], [5]. Một số nghiên cứu trước đây đã chỉ ra mối liên quan của bệnh với tình trạng đột biến gen CYP1B1, LTBP2, MYOC, trong đó đột biến gen CYP1B1 chiếm tỷ lệ cao nhất (10%-100%) [3], [4], đột biến gen MYOC và LTBP2 ít gặp hơn (0%-5,5%) [5], [6], [7], [8], [9]. Đột biến gen CYP1B1 chủ yếu là đột biến điểm nằm rải rác trên toàn bộ chiều dài gen, với tỷ lệ phát hiện đột biến khác nhau giữa các quốc gia trên thế giới (Nhật là 23,1%, Indonesia là 38,1%, Ấn Độ là 44% và Ả Rập tỷ lệ này rất cao 100% do tình trạng kết hôn cận huyết gây nên) [8], [9], [10]. Những nghiên cứu ở mức độ in vitro và in vivo đã chỉ ra rằng protein CYP1B1 đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc và duy trì chức năng của mắt [10]. Theo Khan và cộng sự (2012), 90% những người mang đột biến gen CYP1B1 sẽ biểu hiện bệnh ở cả hai mắt với các mức độ khác nhau [11].
Trong 5 năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát đã và đang tập trung đi sâu vào cơ chế bệnh sinh ở mức độ phân tử, làm cơ sở cho việc triển khai chẩn đoán trước sinh cũng như liệu pháp điều trị gen, đồng thời giúp việc quản lý tốt những người mang gen gây bệnh. Tại Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu phân tích đột biến gen cho các bệnh lý di truyền như: ung thư võng mạc, tăng sản thượng thận bẩm sinh, Wilson, Thalassemia…, tuy nhiên các nghiên cứu bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát mới chỉ đề cập về tỉ lệ mắc bệnh, biểu hiện lâm sàng, kết quả điều trị và các biến chứng của bệnh. Hàng năm bệnh viện Mắt Trung ương tiếp nhận khoảng 20 ca bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát mắc mới. Áp dụng phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh để đưa ra những tư vấn di truyền thích hợp sẽ làm giảm tỷ lệ trẻ mắc bệnh trong cộng đồng và về lâu dài sẽ tác động tốt tới sự phát triển kinh tế, xã hội. Xuất phát từ thực tiễn này, đề tài “Nghiên cứu xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát và phát hiện người lành mang gen bệnh” được thực hiện với hai mục tiêu:
1. Xác định đột biến gen CYP1B1 và mối liên quan với lâm sàng trên bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát.
2. Phát hiện người lành mang gen bệnh trên các thành viên gia đình có quan hệ huyết thống với bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát.
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Đại cương bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 3
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 3
1.1.2. Dịch tễ học bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 3
1.1.3. Cơ chế bệnh sinh của bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 4
1.1.4. Chẩn đoán bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 10
1.1.5. Điều trị bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 15
1.2. Đột biến gen CYP1B1 và mối liên quan với lâm sàng 16
1.2.1. Đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 16
1.2.2. Các kỹ thuật phát hiện đột biến gen CYP1B1 22
1.2.3. Mối liên quan giữa bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát với đột biến gen 28
1.3. Đột biến CYP1B1 phát hiện ở người lành mang gen bệnh 31
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36
2.1. Đối tượng nghiên cứu 36
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn 36
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ 36
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 37
2.3. Phương pháp nghiên cứu 37
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu. 37
2.3.2. Cỡ mẫu và chọn mẫu nghiên cứu 37
2.3.3. Phương tiện nghiên cứu 37
2.3.4. Các bước tiến hành nghiên cứu 40
2.4. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 47
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48
3.1. Đặc điểm bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát 48
3.1.1. Phân bố bệnh nhân theo tuổi phát hiện bệnh 48
3.1.2. Phân bố bệnh nhân theo giới 48
3.1.3. Tiền sử bệnh nhân và gia đình 49
3.1.4. Tình trạng mắt bị bệnh của bệnh nhân 49
3.1.5. Phân bố giai đoạn bệnh 49
3.1.6. Triệu chứng cơ năng 50
3.1.7. Dấu hiệu thực thể 50
3.2. Kết quả xác định đột biến gen CYP1B1 và mối liên quan với lâm sàng 52
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA 52
3.2.2. Kết quả xác định đột biến gen CYP1B1 bằng kỹ thuật giải trình tự 52
3.2.3. Kết quả xác định đột biến gen CYP1B1 bằng kỹ thuật MLPA 58
3.2.4. Tỷ lệ đột biến chung của gen CYP1B1 59
3.2.5. Mối liên quan giữa lâm sàng và đột biến gen CYP1B1 62
3.3. Kết quả phát hiện người lành mang gen 72
3.3.1. Phả hệ có di truyền đột biến 75
3.3.2. Phả hệ không di truyền đột biến 81
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 87
4.1. Một số đặc điểm của bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 87
4.1.1. Sự phân bố bệnh nhân theo tuổi phát hiện bệnh 87
4.1.2. Sự phân bố bệnh nhân theo giới 87
4.1.3. Tiền sử bệnh nhân và gia đình 88
4.1.4. Tình trạng mắt bị bệnh của bệnh nhân 88
4.1.5. Giai đoạn bệnh của mắt bệnh nhân 88
4.1.6. Triệu chứng cơ năng 89
4.1.7. Dấu hiệu thực thể 89
4.2. Kết quả xác định đột biến gen CYP1B1 và mối liên quan với lâm sàng bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 91
4.2.1. Tình trạng đột biến gen CYP1B1 91
4.2.2. Mối liên quan giữa lâm sàng và đột biến gen CYP1B1 96
4.3. Đột biến gen CYP1B1 trong các thành viên gia đình bệnh nhân 104
4.3.1. Các phả hệ có di truyền đột biến 105
4.3.2. Các phả hệ không di truyền đột biến 110
KẾT LUẬN 118
ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 120
HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 121
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các loại đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát tại các nước khác nhau tính đến năm 2010 17
Bảng 1.2. Các loại đột biến gen CYP1B1 hay gặp theo vùng lãnh thổ 19
Bảng 1.3. Phân loại mức độ nặng của bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 30
Bảng 1.4. Lâm sàng và điều trị của bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát trong phả hệ 33
Bảng 2.1. Tên, kích thước và vị trí của các sản phẩm PCR trong Kit MLPA P128-CYP450 (MRC- Holland) 39
Bảng 2.2. Trình tự mồi dùng cho phản ứng PCR 43
Bảng 3.1. Tuổi phát hiện bệnh 48
Bảng 3.2. Phân bố mắt theo giai đoạn bệnh 50
Bảng 3.3. Tỷ lệ các triệu chứng cơ năng 50
Bảng 3.4. Tình trạng giác mạc của nhóm nghiên cứu 51
Bảng 3.5. Kết quả dự đoán gây bệnh của đột biến điểm mới gen CYP1B1 56
Bảng 3.6. Các đa hình SNP của gen CYP1B1 trên bệnh nhân nghiên cứu 57
Bảng 3.7. Đặc điểm bệnh nhân mang đột biến trên gen CYP1B1 60
Bảng 3.8. Tỷ lệ các dạng đột biến gen CYP1B1 62
Bảng 3.9. Mối liên quan giữa thời gian phát hiện bệnh và đột biến gen 63
Bảng 3.10. Mối liên quan giữa giới tính và tình trạng đột biến gen 63
Bảng 3.11. Mối liên quan giữa tiền sử mắc bệnh của mẹ khi mang thai với tình trạng đột biến gen CYP1B1 64
Bảng 3.12. Mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen với số mắt bị bệnh 64
Bảng 3.13. Mối liên quan giữa giai đoạn bệnh với tình trạng đột biến gen 65
Bảng 3.14. Mối liên quan giữa nhãn áp với đột biến gen CYP1B1 66
Bảng 3.15. Mối liên quan giữa đường kính giác mạc với đột biến gen 66
Bảng 3.16. Mối liên quan giữa chiều dài trục nhãn cầu với đột biến gen 67
Bảng 3.17. Mối liên quan giữa mức độ lõm đĩa với đột biến gen CYP1B1 67
Bảng 3.18. Mối liên quan giữa số lần phẫu thuật với tình trạng đột biến 68
Bảng 3.19. Mối liên quan giữa thời gian xuất hiện bệnh với tình trạng đột biến 70
Bảng 3.20. Mối liên quan giữa thời gian xuất hiện bệnh và số mắt bị bệnh với tình trạng đột biến 71
Bảng 3.21. Mối liên quan giữa thời gian xuất hiện bệnh, số mắt bị bệnh và giai đoạn bệnh với tình trạng đột biến 72
Bảng 3.22. Tỷ lệ phát hiện đột biến gen CYP1B1 di truyền qua các thế hệ 73
Bảng 3.23. Đột biến gen CYP1B1 của các thành viên gia đình bệnh nhân 74
Bảng 3.24. Kết quả phát hiện đa hình gen một số gia đình bệnh nhân 75
Bảng 4.1. Kết quả phát hiện tỷ lệ đột biến ở bệnh nhân châu Á 93
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Phát triển một phần mống mắt trên bề mặt vùng bè 4
Hình 1.2. Vị trí của gen MYOC trên nhánh dài nhiễm sắc thể 1 5
Hình 1.3. Vị trí của gen LTBP2 trên nhánh dài nhiễm sắc thể 14 5
Hình 1.4. Vị trí của gen CYP1B1 trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể 2 6
Hình 1.5. Hình ảnh không gian 3 chiều vùng C’ tận của protein CYP1B1 7
Hình 1.6. Sơ đồ minh họa cơ chế ảnh hưởng của đột biến gen CYP1B1 9
Hình 1.7. Vết rạn giác mạc màng Descemet 11
Hình 1.8. Hình ảnh soi góc tiền phòng 12
Hình 1.9. Vị trí đột biến gen CYP1B1 thường gặp 20
Hình 1.10. Loại và vị trí đột biến gen CYP1B1 thường gặp ở người châu Á 20
Hình 1.11. Loại và vị trí đột biến gen CYP1B1 thường gặp ở người da trắng 21
Hình 1.12. Loại và vị trí đột biến gen CYP1B1 thường gặp ở người Di-gan 22
Hình 1.13. Loại và vị trí đột biến gen CYP1B1 gặp ở người Trung Đông 22
Hình 1.14. PCR khuếch đại exon 2, gen CYP1B1 đột biến p.G61E 23
Hình 1.15. Cấu trúc phân tử dNTP và ddNTP 24
Hình 1.16. Quá trình tổng hợp DNA bình thường (A)và DNA bị ức chế (B) 25
Hình 1.17. Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP 26
Hình 1.18. Các giai đoạn của Kỹ thuật MLPA (Schouten, 2002) 27
Hình 1.19. Tỷ lệ phẫu thuật thành công ở nhóm có và không có đột biến 31
Hình 1.20. Hình ảnh giải trình tự gen của đột biến p.E173K 32
Hình 1.21. Phả hệ gia đình bệnh nhân mang đột biến gen p.E173K 33
Hình 1.22. Phả hệ gia đình Nhật Bản mang đột biến Asp192Val và Val364Met 34
Hình 1.23. Phả hệ 5 gia đình bệnh nhân Việt Nam mang đột biến gen CYP1B1 34
Hình 1.24. Phả hệ các gia đình bệnh nhân tại Tây Ban Nha 35
Hình 2.1. Kết quả MLPA sử dụng Kit MLPA P128-CYP450 39
Hình 3.1. Sản phẩm PCR exon 2 (A), exon 3 (B) của gen CYP1B1 (+)mẫu đối chứng dương, (-) mẫu đối chứng âm, (1-5) mẫu bệnh nhân, (MK) Marker 52
Hình 3.2. Hình ảnh cấu trúc gen CYP1B1 với đột biến p.E229K 54
Hình 3.3. Hình ảnh đột biến gen của bệnh nhân mã G15 54
Hình 3.4. Hình ảnh đột biến gen của bệnh nhân mã G09 55
Hình 3.5. Hình ảnh đột biến gen của bệnh nhân mã G24 55
Hình 3.6. Hình ảnh cấu trúc gen CYP1B1 với 04 đột biến mới 57
Hình 3.7. Hình ảnh MLPA (hình trái) và kết quả tính toán (Relative Peak Area) bằng phần mềm coffalyser (hình phải) của bệnh nhân G40 và G02. 58
Hình 3.8. Hình ảnh MLPA (hình trái) và kết quả tính toán (Relative Peak Area) bằng phần mềm coffalyser (hình phải) của bệnh nhân G45 và G56. 59
Hình 3.9. Mối liên quan giữa phương pháp phẫu thuật với đột biến gen 69
Hình 3.10. Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G40 76
Hình 3.11. Hình ảnh đột biến gen của gia đình bệnh nhân mã số G40 77
Hình 3.12. Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G85 78
Hình 3.13. Hình ảnh đột biến gen của gia đình bệnh nhân mã số G85 79
Hình 3.14. Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G02 79
Hình 3.15. Hình ảnh MLPA của các thành viên gia đình bệnh nhân mã số G02. Các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, exon 3 của gen CYP1B1. 80
Hình 3.16. Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G56 81
Hình 3.17. Phả hệ gia đình bệnh nhân G08 81
Hình 3.18. Hình ảnh đột biến p.Q86K ở bệnh nhân G08 82
Hình 3.19. Hình ảnh đa hình gen ở gia đình bệnh nhân G08 82
Hình 3.20. Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G11 83
Hình 3.21. Đa hình gen p.L432V ở gia đình G11 83
Hình 3.22. Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G19 84
Hình 3.23. Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G20 84
Hình 3.24. Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G21 85
Hình 3.25. Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G24 86