Nghiên cứu xác định Đột biến gen f8 gây bệnh HEMOPHILIA a

Luận án Nghiên cứu xác định Đột biến gen f8 gây bệnh HEMOPHILIA a.Bệnh hemophilia hay còn gọi là bệnh rối loạn đông máu. Đây là một bệnh di truyền do thiếu hụt hay bất thƣờng chức năng của các yếu tố đông máu huyết tƣơng, nhƣ các yếu tố VIII, IX hay XI. Bệnh đặc trƣng bởi thời gian đông máu kéo dài và tăng nguy cơ chảy máu; biểu hiện lâm sàng chủ yếu là xuất huyết, xuất huyết có thể tự nhiên hoặc sau chấn thƣơng nhẹ. Đặc điểm xuất huyết là đám máu bầm dƣới da, tụ máu trong cơ, chảy máu ở các khớp.

Nghiên cứu xác định Đột biến gen f8 gây bệnh HEMOPHILIA a Tỷ lệ mắc ở các nước có thể là khác nhau nhưng tần suất chung khoảng 30-100/1.000.000 dân [1]. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về bệnh hemophilia và dự kiến sẽ có khoảng 550.000 ngƣời bị bệnh hemophilia vào năm 2020, ở Việt Nam hiện nay có khoảng 6000 bệnh nhân trong đó chỉ có 30% đƣợc phát hiện và điều trị [2].Hemophilia là bệnh di truyền lặn liên quan đến giới tính, gen bệnh nằm trên nhiễm sắc thể X. Ngƣời mẹ mang gen bệnh có khả năng truyền bệnh cho 50% con trai của họ, do vậy chủ yếu bệnh nhân là nam. Có 3 loại hemophilia, sự giảm yếu tố VIII gây ra bệnh hemophilia A, thiếu hụt yếu tố IX gây hemophilia B và bất thƣờng yếu tố XI sẽ gây bệnh h emophilia C. Trong đó hemophilia A chiếm 80-85%, hemophilia B chiếm 15-20%, hemophilia C chiếm tỉ lệ rất ít, phổ biến chủ yếu ở ngƣời Do Thái với tỉ lệ mắc đồng hợp tử khoảng 1-3‰ ngƣời Do Thái [3]. Ở bệnh nhân thể nặng, nồng độ protein yếu tố VIII trong máu rất thấp, chỉ ≤ 1% so với ngƣời bình thƣờng (nồng độ yếu tố VIII bình thƣờng là 200 ng/ml).Việt Nam là một nƣớc có tỉ lệ mắc bệnh hemophillia A trong cộng đồng khá cao. Theo nghiên cứu của Đỗ Trung Phấn và cộng sự năm 1996 tỷ lệ mắc bệnh khoảng 25 – 60/1.000.000 ngƣời [4], trong khi đó phƣơng pháp điều trị hiện nay ở nƣớc ta là sử dụng yếu tố VIII trong máu toàn phần (truyền trực tiếp hoặc tách chiết) rất tốn kém và hiệu quả không cao, đặc biệt có nguy cơ cao đối với các bệnh lây truyền qua đƣờng máu.
Trên thế giới, các nhà khoa học đã phân tích gen của bệnh nhân hemophilia A và rất nhiều dạng đột biến gen yếu tố VIII (F8) đƣợc công bố. Các nghiên cứu khẳng định dạng đột biến khác nhau sẽ gây những kiểu hình đặc trƣng khác nhau.
Bệnh nhân hemohilia A thể nặng thƣờng gặp dạng đột biến đảo đoạn exon 22 (chiếm 45-50%), trong khi đó đột biến điểm chiếm đa số ở bệnh nhân hemophilia A thể bệnh vừa và nhẹ (chiếm 90-95%) [5].
Ở Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh hemophilia A, chủ yếu là các nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, đánh giá tỷ lệ mắc bệnh hay các nghiên cứu đánh giá hiệu quả điều trị bệnh bằng các chế phẩm thay thế… Chƣa có công trình nào nghiên cứu toàn diện về đột biến gen  mã hóa yếu tố VIII ở ngƣời Việt Nam, tạo cơ sở dữ liệu để làm tiền đề cho việc xây dựng bản đồ gen ở bệnh nhân hemophilia A Việt Nam.
Với sự tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử, các nhà khoa học có thể phân tích DNA của ngƣời bệnh để xác định chính xác các tổn thƣơng gengây bệnh hemophilia A, cũng nhƣ kiểm soát bệnh tốt hơn nhờ phát hiện ngƣời phụ nữ mang gen bệnh và tƣ vấn di truyền trƣớc hôn nhân, tăng hiệu quả trong việc phòng ngừa bệnh tật đồng thời nâng cao chất lƣợng chăm sóc sức khỏe trong cộng đồng.Nghiên cứu xác định Đột biến gen f8 gây bệnh HEMOPHILIA a
Do vậy, đề tài này đƣợc thực hiện với hai mục tiêu:
1. Phát hiện đột biến gen F8 của bệnh nhân hemophilia A ở Việt Nam.
2. Bước đầu xây dựng bản đồ đột biến gen F8 đối với bệnh nhân hemophilia A tại Việt Nam MỤC LỤC

Nghiên cứu xác định Đột biến gen f8 gây bệnh HEMOPHILIA a
ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………………………………….. 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ……………………………………………………………………. 3
1.1. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH HEMOPHILIA A ………………………. 3
1.2. BỆNH HỌC BỆNH HEMOPHILIA A ………………………………………….. 4
1.2.1. Bệnh hemophilia A ……………………………………………………………….. 4
1.2.2. Vị trí, cấu trúc, chức năng của gen F8 ……………………………………. 10
1.2.3. Bệnh học phân tử bệnh hemophilia A ……………………………………. 14
1.2.4. Mối liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình ………………………………. 16
1.2.5. Yếu tố ức chế FVIII …………………………………………………………….. 19
1.2.6. Di truyền học và tỷ lệ mắc bệnh hemophilia A ……………………….. 21
1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ XÁC ĐỊNH ĐỘT
BIẾN TRÊN GEN F8 …………………………………………………………………. 22
1.3.1. Phƣơng pháp phát hiện đột biến đảo đoạn nhiễm sắc thể ……………. 23
1.3.2. Phƣơng pháp phát hiện các dạng đột biến khác ……………………… 26
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC …………… 30
1.4.1. Nghiên cứu trên thế giới ………………………………………………………. 30
1.4.2. Nghiên cứu tại Việt Nam ……………………………………………………… 32
1.5. NHỮNG VẤN ĐỀ CÒN TỒN TẠI …………………………………………….. 34
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………. 36
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU …………………………………………………….. 36
2.2. DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU …. 37
2.2.1. Dụng cụ ……………………………………………………………………………… 37
2.2.2. Hoá chất …………………………………………………………………………….. 37
2.2.3.Trình tự mồi cho các phản ứng PCR ………………………………………. 39
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………………………………………….. 40
2.3.1. Quy trình lấy mẫu ……………………………………………………………….. 41
2.3.2. Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi …………………………….. 41
2.3.3. Quy trình phát hiện đảo đoạn intron ………………………………………. 42
2.3.4. Kĩ thuật PCR khuếch đại các exon ………………………………………… 48
2.3.5. Kỹ thuật điện di trên gel agarose …………………………………………… 49
2.3.6. Giải trình tự gen ………………………………………………………………….. 49
2.3.7. Phƣơng pháp phân tích kết quả …………………………………………….. 52
2.4. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU …………………………….. 52
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ……………………………………………….. 53
3.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA CÁC ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ……. 53
3.1.1. Đặc điểm về tuổi …………………………………………………………………. 53
3.1.2. Tỷ lệ bệnh nhân chia theo thể bệnh ……………………………………….. 54
3.2. KẾT QUẢ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN F8 ……………………………… 54
3.2.1. Tỷ lệ phát hiện đƣợc đột biến ……………………………………………….. 54
3.2.2. Kết quả phát hiện các dạng đột biến gen F8 ở bệnh nhân
hemophilia A …………………………………………………………………….. 55
3.2.3. Đánh giá nguy cơ phát triển chất ức chế yếu tố VIII ……………….. 70
3.3. LẬP BẢN ĐỒ ĐỘT BIẾN GEN F8 GÂY BỆNH HEMOPHILIA A Ở
VIỆT NAM ……………………………………………………………………………….. 73
3.3.1. Kết quả các vị trí đột biến gen F8 ở bệnh nhân hemophilia A
Việt Nam …………………………………………………………………………… 73
3.3.2. Tỷ lệ các dạng đột biến khác nhau trên bệnh nhân hemophilia A ở
Việt Nam …………………………………………………………………………… 75
3.3.3. Tỷ lệ các dạng đột biến trên các vùng của gen F8 …………………… 76
3.3.4. Bản đồ đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A ở Việt Nam …… 76
Chƣơng 4: BÀN LUẬN ……………………………………………………………………… 78
4.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ………………. 78
4.2. PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN F8 Ở BỆNH NHÂN HEMOPHILIA A
CỦA VIỆT NAM ………………………………………………………………………. 82
4.2.1. Tỷ lệ phát hiện đột biến gen F8 ở bệnh nhân hemophilia A ……… 82
4.2.2. Các dạng đột biến gây bệnh hemophilia A ở Việt Nam ……………. 84
4.2.3. Đánh giá nguy cơ hình thành chất ức chế ………………………………. 94
4.3. XÂY DỰNG BẢN ĐỒ ĐỘT BIẾN GEN F8 ĐỐI VỚI BỆNH NHÂN
HEMOPHILIA A TẠI VIỆT NAM ……………………………………………… 98
4.3.1. Vị trí đột biến gây bệnh hemophilia A …………………………………… 98
4.3.2. Tần suất hay gặp ở một số vị trí đột biến ……………………………… 104
4.3.3. Tỉ lệ phát hiện đột biến trên từng exon …………………………………. 104
KẾT LUẬN …………………………………………………………………………………….. 107
KIẾN NGHỊ ……………………………………………………………………………………. 108
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC