Nghiên cứu xác định đột biến và lập bản đồ đột biến gen dystrophin
Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu xác định đột biến và lập bản đồ đột biến gen dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne Việt Nam. Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy-DMD) là một bệnh lý thần kinh cơ do di truyền thường gặp nhất, được phát hiện ở tất cả các chủng tộc khác nhau trên thế giới. Tần suất bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai. Duchenne là người đầu tiên đã mô tả chi tiết bệnh này vào năm 1861 [1]. Đây là một bệnh lý cơ rất nặng, mang tính chất tuần tiến, nặng dần theo thời gian. Hầu hết trẻ trai mắc bệnh đều có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng suy yếu cơ, biểu hiện bằng khó đi lại, khó đứng lên ngồi xuống và khó khăn khi leo cầu thang. Trong giai đoạn nặng, bệnh nhân trở nên tàn phế, mất khả năng đi lại vào lứa tuổi 12 và thường tử vong ngoài 20 tuổi do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp [2, 3]. Một thể bệnh nhẹ của DMD rất hay gặp là loạn dưỡng cơ Becker (BMD). Bệnh nhân BMD xuất hiện triệu chứng lâm sàng muộn hơn DMD, biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn và thời gian tiến triển chậm hơn. Với những biểu hiện nặng nề, cùng với rối loạn về tinh thần, DMD/BMD thực sự không chỉ là một tai họa đối với bản thân người bệnh mà còn là gánh nặng của gia đình cũng như của cả cộng đồng.
DMD/BMD là bệnh di truyền lặn liên kết giới tính, gây nên bởi đột biến gen dystrophin. Gen dystrophin nằm ở vị trí Xp21 trên nhiễm sắc thể X, có chiều dài hơn 3000 kb, gồm 79 exon với 7 promotor khác nhau và là gen người lớn nhất được phát hiện cho đến nay. Gen dystrophin mã hoá 14 kb mRNA và tổng hợp sản phẩm tương ứng là protein dystrophin. Protein này có mặt ở màng của tế bào cơ và có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định màng, bảo vệ tế bào cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ [4, 5].
Hiện nay, bản đồ đột biến gen dystrophin gần như đã được xác định. Dạng đột biến xóa đoạn gen là phổ biến nhất, chiếm 60%. Dạng đột biến điểm đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 20-30%. Dạng đột biến lặp đoạn chiếm khoảng 10-15% [5]. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy, đột biến xóa đoạn gen thường tập trung vào hai vùng trọng điểm (hotspot): vùng trung tâm (exon 43-60) và vùng 5’ tận (exon 1-19) [3, 6]. Đột biến điểm và đột biến lặp đoạn nằm rải rác trên chiều dài gen [5].
Hiện nay chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu. Với sự phát triển của ngành sinh học phân tử trong những năm gần đây, liệu pháp điều trị gen đối với bệnh nhân DMD đã đem lại hy vọng to lớn cho người bệnh. Tuy nhiên với mỗi dạng đột biến gen dystrophin khác nhau sẽ có liệu pháp điều trị gen khác nhau. Vì vậy, việc nghiên cứu xác định đột biến gen cho bệnh nhân là tiền đề quan trọng để lựa chọn liệu pháp điều trị gen hiệu quả nhất. Ngoài ra, việc xác định chính xác dạng đột biến gen còn giúp cho chẩn đoán người lành mang bệnh, chẩn đoán trước sinh tư vấn di truyền nhằm giảm tỉ lệ mắc bệnh, giảm hậu quả của bệnh gây cho gia đình bệnh nhân và xã hội.
Những năm gần đây, nhiều nhà khoa học nước ngoài cũng như trong nước đã tiến hành nghiên cứu và phát hiện đột biến gen dystrophin ở các bệnh nhân DMD. Ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về đột biến gen dystrophin. Tuy nhiên, các công trình chủ yếu mới chỉ dừng ở phát hiện đột biến xóa đoạn và tập trung vào 2 vùng đột biến trọng điểm, vẫn chưa có nghiên cứu nào tiến hành phát hiện toàn diện các dạng đột biến xóa đoạn, đột biến lặp đoạn và đột biến điểm trên toàn bộ 79 exon của gen dystrophin.
Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài “Nghiên cứu xác định đột biến và lập bản đồ đột biến gen dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne Việt Nam” được tiến hành với các mục tiêu sau:
1. Xác định đột biến xóa đoạn, lặp đoạn và đột biến điểm của gen dystrophin trên bệnh nhân DMD/BMD.
2. Bước đầu xây dựng bản đồ đột biến gen dystrophin trên bệnh nhân DMD/BMD Việt Nam.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC
ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Đỗ Ngọc Hải, Trần Vân Khánh, Tạ Minh Hiếu, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn (2012), “Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen dystrophin trên bệnh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne”, Tạp ch ỉ nghiên cứu Y học, 80(3C), tr 8-14.
2. Đỗ Ngọc Hải, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn, Trần Vân Khánh (2012), “Phân tích đột biến gen Dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne”, Tạp ch ỉ nghiên cứu Y học, 80(4), tr. 1 – 6.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Kliegman, Robert, et al. (2012), Nelson textbook of pediatrics, Elsevier/Saunders.
2. Bushby, K., et al. (2010), “Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisciplinary care “, Lancet Neurol. 9(2), pp. 177-89.
3. Kneppers, A. L., Ginjaar, I. B., and Bakker, E. (2004), “Duchenne and Becker muscular dystrophy”, Methods Mol Med. 92, pp. 311-41.
4. Den Dunnen, J. T., et al. (1992), “Reconstruction of the 2.4 Mb human DMD-gene by homologous YAC recombination”, Hum Mol Genet. 1(1), pp. 19-28.
5. Prior, T. W. and Bridgeman, S. J. (2005), “Experience and strategy for the molecular testing of Duchenne muscular dystrophy”, J Mol Diagn. 7(3), pp. 317-26.
6. Tạ Thành Văn (2011), Bệnh loạn dưỡng cơ Duchene và Becker, Bệnh học phân tử, Nhà xuất bản Y học.
7. Meryon, E. (1852), “On Granular and Fatty Degeneration of the Voluntary Muscles”, Med Chir Trans. 35, pp. 73-84 1.
8. Behrman J, Kliegman L, and Arvin E (1998), Neuromuscular Disorders, 15 ed, Nelson texbooks of pediatrics.
9. Clarke, J. L. and Gowers, W. R. (1874), “On a Case of Pseudo¬hypertrophic Muscular Paralysis”, Med Chir Trans. 57, pp. 247-260 5.
10. Zatz, M., et al. (1991), “Serum creatine-kinase (CK) and pyruvate¬kinase (PK) activities in Duchenne (DMD) as compared with Becker (BMD) muscular dystrophy”, J Neurol Sci. 102(2), pp. 190-6.
11. Bodrug, S. E., et al. (1987), “Molecular analysis of a constitutional X- autosome translocation in a female with muscular dystrophy”, Science. 237(4822), pp. 1620-4.
12. Hoffman, E. P., Brown, R. H., and Kunkel, L. M. (1987), “Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus”, Cell. 51, pp. 919-928.
13. Emery, A. E. (1993), “Duchenne muscular dystrophy–Meryon’s disease”, NeuromusculDisord. 3(4), pp. 263-6.
14. Emery, A. E. (2002), “The muscular dystrophies”, Lancet. 359(9307), pp. 687-95.
15. Ozawa, E., Hagiwara, Y., and Yoshida, M. (1999), “Creatine kinase, cell membrane and Duchenne muscular dystrophy”, Mol Cell Biochem. 190(1-2), pp. 143-51.
16. Sabatelli, Patrizia, et al. (2012), Cytoskeletal and extracellular matrix alterations in limb girdle muscular dystrophy 2I muscle fibers.
17. Drachman, D. B., Toyka, K. V., and Myer, E. (1974), “Prednisone in Duchenne muscular dystrophy”, Lancet. 2(7894), pp. 1409-12.
18. Balaban, B., et al. (2005), “Corticosteroid treatment and functional improvement in Duchenne muscular dystrophy: long-term effect”, Am J Phys Med Rehabil. 84(11), pp. 843-50.
19. Yilmaz, O., Karaduman, A., and Topaloglu, H. (2004), “Prednisolone therapy in Duchenne muscular dystrophy prolongs ambulation and prevents scoliosis”, Eur J Neurol. 11(8), pp. 541-4.
20. Fabb, S. A., et al. (2002), “Adeno-associated virus vector gene transfer and sarcolemmal expression of a 144 kDa micro-dystrophin effectively restores the dystrophin-associated protein complex and inhibits myofibre degeneration in nude/mdx mice”, Hum. Mol. Genet. 11, pp. 733-741.
21. van Deutekom, Judith C. T. and van Ommen, Gert-Jan B. (2003), “Advances in Duchenne muscular dystrophy gene therapy”, Nat Rev Genet. 4(10), pp. 774-783.
22. Palmer, Edward, Wilhelm, James M., and Sherman, Fred (1979), “Phenotypic suppression of nonsense mutants in yeast by aminoglycoside antibiotics”, Nature. 277(5692), pp. 148-150.
23. Dunckley, M. G., et al. (1998), “Modification of splicing in the dystrophin gene in cultured Mdx muscle cells by antisense oligoribonucleotides”, Hum. Mol. Genet. 7, pp. 1083-1090.
24. Blencowe, B. J. (2000), “Exonic splicing enhancers: mechanism of action, diversity and role in human genetic diseases”, Trends Biochem Sci. 25, pp. 106-110.
25. Cartegni, Luca, Chew, Shern L., and Krainer, Adrian R. (2002), “Listening to silence and understanding nonsense: exonic mutations that affect splicing”, Nat Rev Genet. 3(4), pp. 285-298.
26. Mullard, Asher (2013), “Make or break for first splice-modulating agents”, Nat Rev Drug Discov. 12(11), pp. 813-815.
Foster, K., Foster, H., and Dickson, J. G. (2006), “Gene therapy progress and prospects: Duchenne muscular dystrophy”, Gene Ther. 13(24), pp. 1677-85.
28. Matsuo, M. (2002), “Duchenne and Becker muscular dystrophy: from gene diagnosis to molecular therapy”, IUBMBLife. 53(3), pp. 147-52.
29. Gussoni, E. (1999), “Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation”, Nature. 401, pp. 390-394.
30. Gussoni, E., Blau, H. M., and Kunkel, L. M. (1997), “The fate of individual myoblasts after transplantation into muscles of DMD patients”, Nature Med. 3, pp. 970-977.
31. Bar, S., et al. (1990), “A novel product of the Duchenne muscular dystrophy gene which greatly differs from the known isoforms in its structure and tissue distribution”, Biochem J. 272(2), pp. 557-60.
32. Trần Vân Khánh (2005), “Đột biến ở vùng rod của gen dystrophin gây nên bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne”, Tạp ch ỉ Y học Việt Nam. 6, pp. 33-9.
33. Ervasti, J. M. and Campbell, K. P. (1993), “A role for the dystrophin- glycoprotein complex as a transmembrane linker between laminin and actin”, J. Cell. Biol. 122, pp. 809-823.
34. Matsumura, K. and Campbell, K. P. (1994), “Dystrophin-glycoprotein complex: its role in the molecular pathogenesis of muscular dystrophies”, Muscle Nerve. 17(1), pp. 2-15.
35. Dickson, G. and Brown, S. C. (1995), “Duchenne muscular dystrophy”, Mol Cell Biol Hum Dis Ser. 5, pp. 261-80.
36. Bushby, K. M. (1992), “Recent advances in understanding muscular dystrophy”, Arch Dis Child. 67(10), pp. 1310-2.
37. Blake, Derek J., et al. (2002), Function and Genetics of Dystrophin and Dystrophin-Related Proteins in Muscle, Vol. 82, 291-329.
38. Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thanh Liêm và cộng sự (2006), “Đột biến mất đoạn gene Dystrophin của các bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchene/Becker Việt Nam”, Tạp chí Nhi khoa. tập 14 – số đặc biệt, pp. 202 – 208.
39. Monaco, A. P., et al. (1988), “An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus”, Genomics. 2(1), pp. 90-5.
40. Grimm, T., et al. (1994), “On the origin of deletions and point mutations in Duchenne muscular dystrophy: most deletions arise in oogenesis and most point mutations result from events in spermatogenesis”, JMed Genet. 31(3), pp. 183-6.
41. Tuffery-Giraud, S., et al. (1999), “Point mutations in the dystrophin gene: evidence for frequent use of cryptic splice sites as a result of splicing defects”, Hum Mutat. 14(5), pp. 359-68.
42. Korf, Bruce (1995), “Molecular diagnosis”, New England Journal of Medicine. 332(22), pp. 1499-1502.
43. Nguyễn Thị Băng Sương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hoàn và cộng sự (2008), “Phát hiện người lành mang gen bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne bằng phương pháp PCR định lượng”, Tạp ch ỉ Nghiên cứu y học. 59(6), pp. 1 – 10.
44. Lai, K. K., et al. (2006), “Detecting exon deletions and duplications of the DMD gene using Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA)”, Clin Biochem. 39(4), pp. 367-72.
45. Schouten, J. P., et al. (2002), “Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification”,
Nucleic Acids Res. 30(12), p. e57.
46. Schwartz, M and Duno, M (2005), “Multiplex ligation-dependent probe amplification is superior for detecting deletions/duplications in Duchenne muscular dystrophy”, Clin Genet. 67(2), pp. 189-191.
47. Schwartz, Marianne and Duno, Morten (2004), “Improved molecular diagnosis of dystrophin gene mutations using the multiplex ligation- dependent probe amplification method”, Genetic testing. 8(4), pp. 361-367.
48. Janssen, B., et al. (2005), “MLPA analysis for the detection of deletions, duplications and complex rearrangements in the dystrophin gene: potential and pitfalls”, Neurogenetics. 6(1), pp. 29-35.
49. Li, H., et al. (2009), “[Combining approach with multiplex PCR and MLPA to detect deletion and duplication in DMD patients, carriers, and prenatal diagnosis]”, Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 26(3), pp. 318-22.
50. Marzese, D. M., et al. (2008), “Detection of deletions and duplications in the Duchenne muscular dystrophy gene by the molecular method MLPA in the first Argentine affected families”, Genet Mol Res. 7(1), pp. 223-33.
51. Shendure, Jay and Ji, Hanlee (2008), “Next-generation DNA sequencing”, Nat Biotech. 26(10), pp. 1135-1145.
52. Sakthivel, Murugan SM, Chandramohan, Arthi, and Lakshmi, Bremadesam Raman (2010), “Use of multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) for Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene mutation analysis”.
53. Torella, Annalaura, et al. (2010), “One hundred twenty-one dystrophin point mutations detected from stored DNA samples by combinatorial denaturing high-performance liquid chromatography”, The Journal of Molecular Diagnostics. 12(1), pp. 65-73.
54. Prior, Thomas W, et al. (1995), “Spectrum of small mutations in the dystrophin coding region”, American journal of human genetics. 57(1),
p. 22.
55. Takeshima, Yasuhiro, et al. (2010), “Mutation spectrum of the dystrophin gene in 442 Duchenne/Becker muscular dystrophy cases from one Japanese referral center”, Journal of human genetics. 55(6), pp. 379-388.
56. Barton-Davis, E. R., et al. (1999), “Aminoglycoside antibiotics restore dystrophin function to skeletal muscles of mdx mice “, J. Clin. Invest. 104, pp. 375-381.
57. Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Thị Phượng (1996), Giá trị của CK trong chan đoán và phát hiện dị hợp tử của bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne, Di truyền học và ứng dụng, Vol. 2, Hội di truyền học Việt Nam xuất bản.
58. Nguyễn Thị Phượng, Vũ Chí Dũng (2002), “Kết quả bước đầu phát hiện đột biến gen gây bệnh DMD ở Việt Nam”, Tạp ch ỉ Nhi khoa. 10(10), pp. 521-6.
59. Trần Vân Khánh và cộng sự (2004), “Chẩn đoán 85 bệnh nhân Việt Nam mắc bệnh nhược cơ Duchenne/Becker bằng phương pháp polymerase chain reaction”, Tạp ch ỉ Y học Việt Nam. 12, pp. 33-8.
60. Nguyễn Thị Trang, Hoàng Hạnh Phúc và cộng sự (2004), “Định lượng creatine kinase phối hợp với lâm sàng và phân tích phả hệ góp phần chẩn đoán một số bệnh cơ di truyền”, Tạp ch ỉ Nghiên cứu y học. 32(6), pp. 133-9.
61. Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Thị Hoàn (2005), Phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin ở một số bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne bằng kỹ thuật Multiplex PCR, Những vẩn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sổng, Báo cáo hội nghị toàn quốc 3/11/2005, pp. 1435-7.
62. Nguyễn Thị Trang và cộng sự (2006), “Phát hiện đột biến mất đoạn exon 46 và 51 gen dystrophin ở một số bệnh nhân DMD bằng kỹ thuật PCR”, Tạp ch ỉ nghiên cứu y học. 45(5), pp. 18-23.
63. Nguyễn Thị Phương Mai, Vũ Chí Dũng, Hoàng Thị Thanh và cộng sự (2007), Áp dụng kỹ thuật multiplex PCR thay thế PCR cổ điển trong phân tích gen dystrophin ở các bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne, Hội nghị nhi khoa Việt Úc, Editor Editors, Bệnh viện Nhi đồng 1 TP HCM, p. 111.
64. Nguyễn Khắc Hân Hoan, Phạm Ngọc Khôi và cộng sự (2009), “Phát hiện đột biến mất đoạn gen gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchene và Becker bằng kỹ thuật MLPA”, Y học TP. Hồ Ch ỉ Minh. 13(2), pp. 169 – 175.
65. Nguyễn Thị Băng Sương, Trần Vân Khánh và cộng sự (2009), “Xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin ở mức độ mRNA”, Tạp ch ỉ Y học TPHCM. 13(2), pp. 98 – 104.
66. Rappolee, Daniel A, et al. (1989), “Novel method for studying mRNA phenotypes in single or small numbers of cells”, Journal of cellular biochemistry. 39(1), pp. 1-11.
Bennett, R. R., et al. (2001), “Detection of mutations in the dystrophin gene via automated DHPLC screening and direct sequencing”, BMC Genet. 2, p. 17.
68. Roberts, Roland G, et al. (1993), “Exon structure of the human dystrophin gene”, Genomics. 16(2), pp. 536-538.
69. Ahn, Andrew H and Kunkel, Louis M (1993), “The structural and functional diversity of dystrophin”, Nature genetics. 3(4), pp. 283-291.
70. Adeli, K and Ogbonna, G. (1990), “Rapid purification of human DNA from whole blood for potential application in clinical chemistry laboratories”, Clinical chemistry. 36(2), pp. 261-264.
71. Tay, Stacey Kiat Hong, et al. (2006), “Diagnostic strategy for the detection of dystrophin gene mutations in asian patients and carriers using immortalized cell lines”, Journal of child neurology. 21(2), pp. 150-155.
72. Armour, JAL, et al. (2002), “The detection of large deletions or duplications in genomic DNA”, Human mutation. 20(5), pp. 325-337.
73. Den Dunnen, JT, et al. (1989), “Topography of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene: FIGE and cDNA analysis of 194 cases reveals 115 deletions and 13 duplications”, American journal of human genetics. 45(6), p. 835.
74. Stuppia, Liborio, et al. (2012), “Use of the MLPA assay in the molecular diagnosis of gene copy number alterations in human genetic diseases”, International journal of molecular sciences. 13(3), pp. 3245¬3276.
Lalic, Tanja, et al. (2005), “Deletion and duplication screening in the DMD gene using MLPA”, European journal of human genetics. 13(11), pp. 1231-1234.
76. Koenig, M., Monaco, A.P., and Kunkel, L. M. (1988), “The complete sequence of dystrophin predicts a rod-shaped cytoskeletal protein”, Cell. 53, pp. 219-226.
77. Zimowski, J. G., et al. (2014), “MLPA based detection of mutations in the dystrophin gene of 180 Polish families with Duchenne/Becker muscular dystrophy”, NeurolNeurochirPol. 48(6), pp. 416-22.
78. Carsana, Antonella, et al. (2010), “A 15-year molecular analysis of DMD/BMD: genetic features in a large cohort”, Front Biosci (Elite Ed). 2, pp. 547-58.
79. Stockley, Tracy L, et al. (2006), “Strategy for comprehensive molecular testing for Duchenne and Becker muscular dystrophies”, Genetic testing. 10(4), pp. 229-243.
80. Hiraishi, Yoshiyuki, et al. (1992), “Quantitative Southern blot analysis in the dystrophin gene of Japanese patients with Duchenne or Becker muscular dystrophy: a high frequency of duplications”, Journal of medical genetics. 29(12), pp. 897-901.
81. Baranov, VS, et al. (1993), “Dystrophin gene analysis and prenatal diagnosis of Duchenne muscular dystrophy in Russia”, Prenatal diagnosis. 13(5), pp. 323-333.
82. Shomrat, Ruth, et al. (1994), “Relatively low proportion of dystrophin gene deletions in Israeli Duchenne and Becker muscular dystrophy patients”, American journal of medical genetics. 49(4), pp. 369-373.
83. Florentin, Lina, et al. (1995), “Deletion patterns of Duchenne and Becker muscular dystrophies in Greece”, Journal of medical genetics. 32(1), pp. 48-51.
84. Patiño, Ana, Narbona, Juan, and García-Delgado, Marina (1995), “Molecular analysis of the Duchenne muscular dystrophy gene in Spanish individuals: Deletion detection and familial diagnosis”, American journal of medical genetics. 59(2), pp. 182-187.
85. Singh, Vinita, et al. (1997), “Proportion and pattern of dystrophin gene deletions in north Indian Duchenne and Becker muscular dystrophy patients”, Human genetics. 99(2), pp. 206-208.
86. Chaudhary, Adeel G, et al. (2008), “Mutation analysis in Saudi Duchenne and Becker muscular dystrophy patients using multiplex PCR”, ARCHIVES OF MEDICAL SCIENCE. 4(1), p. 16.
87. Soong, Bing-Wen, et al. (1991), “DNA polymorphisms and deletion analysis of the Duchenne-Becker muscular dystrophy gene in the chinese”, American journal of medical genetics. 38(4), pp. 593-600.
88. Niemann-Seyde, Susanne, et al. (1992), “Molecular genetic analysis of 67 patients with Duchenne/Becker muscular dystrophy”, Human genetics. 90(1-2), pp. 65-70.
89. Gökgöz, Nalan, et al. (1993), “Screening of deletions and RFLP analysis in Turkish DMD/BMD families by PCR”, Clinical genetics. 43(5), pp. 261-266.
90. Trimarco, Amelia, et al. (2008), “Log-PCR: A New Tool for Immediate and Cost-Effective Diagnosis of up to 85% of Dystrophin Gene Mutations”, Clinical Chemistry. 54(6), pp. 973-981.
91. Zeng, Fanyi, et al. (2008), “Array-MLPA: comprehensive detection of deletions and duplications and its application to DMD patients”, Human mutation. 29(1), pp. 190-197.
92. Wang, Xiaozhu, et al. (2008), “Similarity of DMD gene deletion and duplication in the Chinese patients compared to global populations”, Behav Brain Funct. 4(20), pp. 1-9.
93. Gaudio, Daniela del, et al. (2008), “Molecular diagnosis of Duchenne/Becker muscular dystrophy: enhanced detection of dystrophin gene rearrangements by oligonucleotide array-comparative genomic hybridization”, Human mutation. 29(9), pp. 1100-1107.
94. Flanigan, Kevin M, et al. (2009), “Mutational spectrum of DMD
mutations in dystrophinopathy patients: application of modern
diagnostic techniques to a large cohort”, Human mutation. 30(12), pp. 1657-1666.
95. White, Stefan, et al. (2002), “Comprehensive Detection of Genomic Duplications and Deletions in the< i> DMD</i> Gene, by Use of Multiplex Amplifiable Probe Hybridization”, The American Journal of Human Genetics. 71(2), pp. 365-374.
96. Hegde, Madhuri R, et al. (2008), “Microarray-based mutation detection in the dystrophin gene”, Human mutation. 29(9), pp. 1091-1099.
97. Hwa, Hsiao-Lin, et al. (2007), “Multiplex ligation-dependent probe amplification identification of deletions and duplications of the Duchenne muscular dystrophy gene in Taiwanese subjects”, Journal of the Formosan Medical Association. 106(5), pp. 339-346.
98. Sherratt, T. G., et al. (1993), “Exon skipping and translation in patients with frameshift deletions in the dystrophin gene”, Am J. Hum. Genet. 53, pp. 1007-1015.
99. Welch, Ellen M, et al. (2007), “PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations”, Nature. 447(7140), pp. 87-91.
100. Cirak, Sebahattin, et al. (2011), “Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study”, The Lancet. 378(9791), pp. 595-605.
101. Beroud, Christophe, et al. (2007), “Multiexon skipping leading to an artificial DMD protein lacking amino acids from exons 45 through 55 could rescue up to 63% of patients with Duchenne muscular dystrophy”, Human mutation. 28(2), pp. 196-202.
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Đặc điểm của bệnh DMD 3
1.1.1. Lịch sử phát hiện bệnh 3
1.1.2. Biểu hiện lâm sàng của DMD 5
1.1.3. Xét nghiệm cận lâm sàng 7
1.1.4. Điều trị bệnh DMD 11
1.1.5. Di truyền học của bệnh DMD 20
1.1.6. Bệnh học phân tử bệnh DMD 22
1.2. Các dạng đột biến cấu trúc của gen dystrophin 27
1.2.1. Đột biến xóa đoạn gen 27
1.2.2. Đột biến lặp đoạn gen 29
1.2.3. Đột biến điểm và những đột biến nhỏ khác 29
1.3. Các kỹ thuật phát hiện đột biến gen dystrophin 30
1.3.1. Kỹ thuật PCR 30
1.3.2. Kỹ thuật FISH 31
1.3.3. Kỹ thuật Southern blot 32
1.3.4. Kỹ thuật MLPA 33
1.3.5. Kỹ thuật giải trình tự gen bằng máy tự động 38
1.4. Tình hình nghiên cứu bệnh DMD 39
1.4.1. Trên thế giới 39
1.4.2. Tại Việt Nam 42
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45
2.1. Đối tượng nghiên cứu 45
2.2. Phương pháp nghiên cứu 45
2.3. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 46
2.3.1. Dụng cụ 46
2.3.2. Hoá chất 46
2.4. Quy trình nghiên cứu 49
2.4.1. Lấy mẫu 49
2.4.2. Địa điểm nghiên cứu 49
2.4.3. Quy trình 49
2.4.4. Kỹ thuật giải trình tự gen xác định đột biến điểm 57
2.5. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 59
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 60
3.1. Kết quả tách chiết DNA, RNA, tổng hợp cDNA 60
3.2. Kết quả xác định đột biến gen dystrophin 61
3.2.1. Kết quả xác định đột biến bằng kỹ thuật MLPA 61
3.2.2. Kết quả xác định đột biến bằng kỹ thuật giải trình tự gen 74
3.3 Bản đồ đột biến gen dystrophin trên bệnh nhân DMD/BMD Việt Nam …. 78
3.3.1. Phân bố các dạng đột biến gen dystrophin 78
3.3.2. Phân bố các dạng đột biến xoá đoạn gen dystrophin 81
3.3.3. Phân bố các dạng đột biến lặp đoạn gen dystrophin 82
3.3.4. Phân bố các dạng đột biến điểm gen dystrophin 84
Chương 4: BÀN LUẬN 87
4.1. Quy trình tách chiết DNA, RNA và tổng hợp cDNA 88
4.2. Xác định đột biến gen dystrophin 90
4.2.1. Xác định đột biến bằng kỹ thuật MLPA 90
4.2.2. Đột biến điểm bằng kỹ thuật giải trình tự gen 105
4.3. Một số ứng dụng của bản đồ đột biến trong điều trị và chẩn đoán người
mang gen 107
KẾT LUẬN 110
KIẾN NGHỊ 111
MỘT SỐ CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
Bảng 2.1. Kiểu gen bố mẹ và tỷ lệ bị bệnh ở thế hệ con 21
Bảng 3.1. Kết quả phát hiện đột biến xóa đoạn gen dystrophin 68
Bảng 3.2. Kết quả phát hiện đột biến lặp đoạn trên gen dystrophin 72
Bảng 3.3. Kết quả đột biến điểm trên gen dystrophin 77
Bảng 3.4. Tỉ lệ phân bố các dạng đột biến gen dystrophin 78
Bảng 3.5. Tỉ lệ phân bố các dạng đột biến gen trên bệnh nhân DMD và
BMD 79
Bảng 3.6. Tỉ lệ các dạng đột xóa đoạn 81
Bảng 3.7. Tỉ lệ phân bố vùng đột biến xoá đoạn 82
Bảng 3.8. Tỉ lệ các dạng đột biến lặp đoạn 82
Bảng 3.9. Tỉ lệ phân bố vùng đột biến lặp đoạn 83
Bảng 3.10. Tỉ lệ phân bố các dạng đột biến điểm 84
Bảng 4.1. Ưu và nhược điểm của kỹ thuật MLPA so với một số kỹ thuật
sinh học phân tử thông dụng khác 93
Bảng 4.2. So sánh vùng đột biến xóa đoạn với các nghiên cứu khác 102
Bảng 4.3. So sánh tỉ lệ đột biến lặp đoạn và xóa đoạn 104
Biểu đồ 3.1. Các dạng đột biến gen dystrophin trên bệnh nhân DMD 79
Biểu đồ 3.2. Các dạng đột biến gen dystrophin trên bệnh nhân BMD 80
Biểu đồ 3.3. Tỉ lệ các dạng đột biến xóa đoạn 81
Biểu đồ 3.4. Tỉ lệ các dạng đột biến lặp đoạn 83
Biểu đồ 3.5. Các dạng đột biến điểm trên gen dystrophin 84
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Dấu hiệu Gower 5
Hình 1.2. Hình ảnh hóa mô miễn dịch của protein dystrophin khi nhuộm
tiêu bản sinh thiết cơ 10
Hình 1.3. Cấu trúc phân tử mRNA dystrophin trưởng thành và các mô hình
micro và mini dystrophin 15
Hình 1.4. Gentamicin giúp bộ máy dịch mã của tế bào vượt qua mã dừng đột biến bằng việc sử dụng axit amin glutamin cho mã dừng UAG. . 17
Hình 1.5. Vai trò của vùng ESE trong quá trình cắt nối exon-intron 18
Hình 1.6. Mô hình liệu pháp sử dụng AON gây xóa exon khôi phục lại
khung dịch mã dystrophin 19
Hình 1.7. Vị trí của gen DMD trên NST X 23
Hình 1.8. Cấu trúc của gen Dystrophin 24
Hình 1.9. Các vùng chức năng của protein dystrophin 25
Hình 1.10. Cơ chế bệnh sinh của DMD do thiếu hụt dystrophin 26
Hình 1.11. Giả thuyết về khung dịch mã trong bệnh Becker và Duchenne … 28
Hình 1.12. Xóa đoạn vùng trung tâm gen DMD 28
Hình 1.13. Phân bố đột biến lặp đoạn gen của bệnh DMD/BMD bằng kỹ thuật
Southern blot 29
Hình 1.14. Nguyên tắc của kỹ thuật multiplex PCR 30
Hình 1.15. Hình ảnh xác định đột biến gen dystrophin bằng kỹ thuật FISH . 32
Hình 1.16. Kỹ thuật Southern blot xác định đột biến gen dystrophin 33
Hình 1.17. Nguyên tắc của kỹ thuật MLPA 35
Hình 1.18. Kết quả MLPA phát hiện xóa đoạn gen DMD ở exon 48-50 37
Hình 1.19. Kết quả MLPA phát hiện đột biến lặp đoạn gen 37
Hình 1.20. Nguyên tắc giải trình tự gen theo Sanger và CS 38
Hình 1.21. Mô hình gây skip exon 19 chuyển từ thể bệnh DMD 42
Hình 2.1. Hình ảnh minh họa cách tính toán exon lặp đoạn tương ứng với
phần mềm GeneMarker 56
Hình 3.1. Kết quả đo nồng độ DNA bằng máy Nanodrop của bệnh nhân MS33 60
Hình 3.2. Kết quả đo nồng độ RNA và cDNA bằng máy Nanodrop của bệnh
nhân MS28 61
Hình 3.3. Kết quả MLPA của bệnh nhân MS1 62
Hình 3.4. Kết quả MLPA của bệnh nhân MS4 63
Hình 3.5. Kết quả MLPA của bệnh nhân MS33 64
Hình 3.6. Kết quả MLPA của bệnh nhân MS24 65
Hình 3.7. Kết quả MLPA của bệnh nhân MS53 66
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR của DNA bệnh nhân MS53 với cặp
mồi 44,45. (-)đối chứng âm, (+)đối chứng dương, (P) mẫu bệnh
nhân 66
Hình 3.9. Kết quả MLPA của bệnh nhân MS3 67
Hình 3.10. Kết quả MLPA của bệnh nhân MS10 70
Hình 3.11. Kết quả MLPA của bệnh nhân mã số MS120 71
Hình 3.12. Kết quả xác định đột biến gen của bệnh nhân mã số MS28 73
Hình 3.13. Kết quả phân tích cDNA của bệnh nhân mã số MS123 75
Hình 3.14. Kết quả phân tích cDNA của bệnh nhân MS128 76
Hình 3.15. Kết quả phân tích cDNA của bệnh nhân MS121 76
Hình 3.16. Bản đồ đột biến xóa đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân
DMD/BMD Việt Nam 85
Hình 3.17. Bản đồ đột biến lặp đoạn, đột biến điểm gen dystrophin trên bệnh nhân DMD/BMD Việt Nam 86