Nghiên cứu xác định nhóm lòai An.minimus và An.dirus ở miền Trung-Tây Nguyên bằng kỹ thuật điện di enzym và PCR

An.minimus và An.dirus được xác định là 2 phức hợp loài truyền bệnh sốt rét ở khu vực miền Trung-Tây Nguyên. Từ 3/2002-3/2005 tại 5 địa phương thuộc huyện Trà My-Quảng Nam, huyện Hàm Thuận Nam và Tuy Phong- Bình Thuận, huyện Vân Canh- Bình Định, huyện Khánh Vĩnh- Khánh Hòa và huyện Chư sê, Kbang, Konchro- Gia Lai An.minimus và An.dirus được thu thập để nghiên cứu về thành phần loài bằng 2 kỹ thuật điện di enzym và PCR
–    Kỹ thuật điện di được thực hiện theo phưưng pháp của c.A.Green (1990), công thức nhuộm gel theo Stainer và Joslyn (1990) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Hòan chỉnh kỹ thuật multiplex PCR ( Phuc và cs, 2003 và Hương và cs, 2001) bằng cách sử dụng cả 2 trường hợp mồi riêng biệt và mồi hỗn hợp đều cho kết quả như nhau và đúng kích thước mong đợi của từng lòai trong nhóm Myzomyia và An.dirus.
–    Phân tích điện di enzym Odh 268 mẫu An.clirus xác định alen Odh là alen đơn hình, đặc trưng bằng Odh l()0. Bước đầu xác định được trong khu vực nghiên cứu chỉ có một loài An.dirus .
–    Điện di enzym 395 mẫu An.minimus kiểu hình A, B, c xác định enzym Ođh là đa hình với các alen Odh100, Odh114, Odh80. Odh100 chiếm ưu thế có tần số alen nằm trong khỏang 0,844-0,969, các alen còn lại chiếm tẩn số thấp. Xác định được một loài An.mỉnỉmus đặc trưng bằng alen Odh1()0tại 5 điểm nghiên cứu.
–    Kết quả PCR xác định An dirus thu thập tại các điểm nghiên cứu là lòai An.dirus A
–    Phân tích bằng PCR cho thấy quần thể An.minimus tại Vân Canh – Bình Định là một phức hợp gồm 2 loài A và c. An.minimus kiểu hình A có 67,05% kiểu gen A; 31,36% kiểu gen c và 1,17% kiểu gen AC. An.minimus kiểu hình B có 80% kiểu gen c, 20% kiểu gen A. An.minimus kiểu hình c có 97,48% kiểu gen c. Bằng phương pháp bẫy đèn trong nhà thu thập được 80,95% cá thể An.minimus có kiểu gen A, 4,76% cá thể có kiểu gen C; phương pháp bẫy đèn gia súc thu thập được 55,31% cá thể có kiểu gen c. Quần thể An.minỉmus tại Trà My-Qủang Nam có kiểu hình A, B, c , AC và AB; kết quả PCR cho thấy phần lớn có kiểu gen A, đây là quần thể An.minimus thu thập bằng phương pháp bẫy đèn trong nhà.
Như vậy, kết quả nghiên cứu này cho thấy ở khu vực miền Trung và Tây Nguyên có một loài An.dirus , kết quả PCR cho thấy là loài An.dirus A. Có 2 loài An.minimus A và c không phân biệt được bằng kiểu hình và ở một số địa phương chúng có tập tính sinh học khác nhau.
1.    ĐẶT VÂN ĐỂ
Khu vực miền Trung-Tây Nguyên gồm 15 tỉnh với khoảng 14 triệu dân, là khu vực có bệnh sốt rét lưu hành cao so với cả nước. Dẫn liệu năm 2003, tình hình bệnh nhân sốt rét (BNSR)/1000 dân: 4,87%, tỷ lệ KSTSR/lam: 2,65%, tổng số trường hợp sốt rét ác tính là 318, số tử vong do sốt rét là 39. Cùng với việc quản lý, điều trị BNSR…công tác phòng chống vector thực hiện hàng năm trong các vùng lưu hành sốt rét là dùng hoá chất phun tổn lun và tẩm màn. Biện pháp này đã mang lại hiệu quả đáng kể như giảm tỷ lệ BNSR, KSTSR và khống chế các vụ dịch sốt rét. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng An. minimus và An.dirus là 2 vector truyền bệnh chính ở khu vực, và đây cũng là 2 phức hợp loài có nhiều sự khác biệt về hình thái, tập tính đốt mồi, vai trò truyền bệnh… Việc phân loại dựa vào hình thái các loài này có thể dẫn đến sự nhầm lẫn. Trong những năm gần đây đã có một số công trình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật điện di enzym Odh xác định có 2 loài An.minimus A và c ở miền Bắc Việt Nam (Trịnh Đình Đạt và cộng sự,1992). Với kỹ thuật PCR-RFLP (Van Bortel, 2000) và Multiplex PCR (H.K.Phúc,200L) đã xác định series Myzomyia có 2 loài An.minimus A và c.
Vì vậy việc ứng dụng các kỹ thuật điện di enzym và PCR trong việc xác định các loài trong 2 nhóm loài đa hình di truyền An.minimus và An.dirus là rất cần thiết nhằm xác định chính xác về thành phần loài, hình thái, tập tính sinh học của chúng . Từ đó áp dụng các biện pháp kỹ thuật phòng chống có hiệu quả các loài có vai trò truyền bệnh sốt rét ở khu vực miền Trung-Tây Nguyên.
2.    MỤC TIÊU
1.    Hoàn chỉnh kỹ thuật xác định loài bằng kỹ thuật điện di enzym và PCR.
2.    Xác định thành phần loài trong phức hợp loài An.minimus và An.dirus ở miền
Trung-Tây Nguyên.
3.    TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3.1.    Những nghiên cứu trong nước
Trịnh Đình Đạt và Trương Quang Học, 1992, dùng kỹ thuật điện di nghiên cứu 7 hệ isozyme của phức hợp loài An.minimus và xác định có 2 hệ isozyme ODH và MPI có thể dùng để phân biệt các dạng khác nhau trong nhóm loài An.minimums và các lòai
■ 1191
gan gũi1
Tạ Toàn và Hòang Kim Phúc, 1992, từ hai dòng muỗi An.minimus A và B được tuyển chọn ở 2 vùng tương ứng, phân tích nhiễm sắc thể (NST) X có tâm cân giữa, NST Y có tâm cân mút, các locut isozym Odh và Mpi đều có 2 alen đặc trimg Odh1()()+ Ođh 110 và Mpi l00+ Mpi 105 ■ đã xác định sự khác nhau về tập tính sinh học của 2 lòai An.minimus A và B|1?l.
Trần Đức Hinh và Nguyễn Đức Mạnh, 2000 khi nghiên cứu đặc trưng sự phân bố và trao đổi các dòng gen (gene flow) của An.minimus và nhóm loài An.ỉeucosphynis liên quan đến khả năng truyền bệnh của chúng ở Việt Nam, đã kết luận, dựa vào kiểu gen Oclh, chia An.minimus thành 2 dạng, genotype-I (alen Odh 134 chiếm ưu thế) tương ứng dạng An.minimus c ở Thái Lan, có tập tính ưa đốt máu người ngoài nhà và trú đậu ngoài nhà. Genotype-II (alen Odh 100 chiếm ưu thế), tương đồng dạng An.minimus A ở Thái Lan, tập tính ưa đốt máu người và trú đậu trong nhà1181.
Hồ Đình Trung, Van Bortel w, M. Coosemans, P.Roelants , 2000 bằng kỹ thuật điện di enzyme, RAPD-PCR và PCR-RFLP đã phân biệt An.minimus A và An.minimus c trùng với vùng phân bố tại Phú Cường- Hoà Bình1 ‘4|.
Nguyễn Thị Hương Bình và Trịnh Đình Đạt, 2001 cho rằng có thể dùng hầu hết các hệ enzyme nghiên cứu để phân loại các loài trong series Myzomyia. Kết quả
MỤC LỤC
TRANG
1.    ĐẶT VẤN ĐỀ        5
2.    MUC TIÊU        5
3.    TỔNG ỌUAN TÀỈ LIỆU        5
3.1.    Những nghiên cứu trong nước
3.2.    Những    nghiên cứu ngoài nước
4.    ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN, PHUƠNG PHÁP NGHIÊN cúu        6
4.1.    Địa điểm         6
4.2.    Thời gian nghiên cứu        6
4.3.    Phương pháp nghiên cứu        6
4.3.1.    Phương pháp thu thập mẫu        7
4.3.2.    Kỹ thuật điện di enzym        7
4.3.3.    Ky thuật PCR            :            8
5.    KẾT QUẢ NGHIÊN cúu                9
5.1.    Hoàn thiện kỹ thuật xác định loài bằng điện di enzym và PCR        9
5.1.1.    Kỹ thuật điện di enzym        9
5.1.2.    Kỹ thuật PCR        10
5.2.    Kết quả điện di enzym và PCR xác định nhóm loài        12
5.2.1.    Kết    quả xác định nhóm loài An.minimus và An.dirus bằng kỹ thuật
điện di enzyme        12
5.2.2.    Kết quả xác định nhóm loài An.minimus và An.dirus bằng kỹ thuật
PCR             16
5.3. Sự di truyền kiểu hình của muỗi An.minimus tại một số điểm nghiên cứu ở khu vực miền Trung-Tây Nguyên        19
5.3.1.    Sự di truyền kiểu hình của muỗi An.minimus tại Vân Canh        19
5.3.2.    Sự di truyền kiểu hình của muỗi An.minimus tại Trà My        20
6.    BÀN LUẬN                21
7.    KẾT LUẬN        23
8 . ĐỀ NGHỊ        24
9.    TÀI LIỆU THAM KHẢO        25
10.    PHỤ LỤC        27