Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện gen độc tố của B.cereus trong thực phẩm bằng kỹ thuật Multiplex PCR

Hiện nay Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm (VSATTP) là một trong những vấn đề được ưu tiên hàng đầu của các quốc gia trên thế giới. VSATTP liên quan trực tiếp tới sức khỏe con người. VSATTP không đảm bảo sẽ có thể gây ra những tổn thất không nhỏ cho nền kinh tế. Ước tính mỗi năm có khoảng 3¬4 triệu người bị ngộ độc thực phẩm. Những năm qua, kinh tế nước ta được đổi mới, phát triển và nhiều khởi sắc; đời sống nhân dân được cải thiện. Bên cạnh đó các vụ ngộ độc thức ăn vẫn xảy ra thường xuyên, khắp mọi nơi và ngày càng nhiều mà nguyên nhân chính là do nhiễm khuẩn.
Có 2 dạng ngộ độc chính do vi khuẩn:
+ Do thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn: Salmonella, Shigella, E. coli, Vibrio…
+ Do    thực    phẩm    bị    nhiễm    độc tố    của vi khuẩn:    độc    tố    của tụ    cầu vàng
(Staphylococcus aureus), độc tố của vi khuẩn gây ngộ độc thịt (Clostridium botulinum), độc tố của vi khuẩn gây nhiễm vào các loại ngũ cốc, gia vị, và các loại thực phẩm khác Bacillus cereus (B.cereus).
Ngộ độc do nguyên nhân vi khuẩn chiếm khoảng 2/3 các vụ ngộ độc thực phẩm. B.cereus được biết đến như là một trong những căn nguyên vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm quan trọng ở các nước phát triển và đang phát triển. B.cereus có mặt khắp nơi trong môi trường, nó gây bệnh bằng cách sinh độc tố. Trong thời gian 1973-1985 ngộ độc thực phẩm do B.cereus chiếm khoảng 17,8% các trường hợp ngộ độc thực phẩm tại châu Âu nói chung, 19% tại Hà Lan và xếp thứ 3 trong các nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm tại Đài Loan [17]. B.cereus chiếm khoảng 33% trong tổng số các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm tại Norway trong giai đoạn 1988-1993, những năm 1985-1992 ngộ độc thực phẩm do B.cereus này là 47% ở Iceland và tỷ lệ thấp hơn ở các quốc gia khác: 1,3% ở Mỹ và 2,2% ở Canada.
B.cereus được tìm thấy trong khoảng 25% thực phẩm lấy mẫu: kem, bánh, thịt, khoai tây, sữa, gạo. Ô nhiễm của các sản phẩm thực phẩm thường xảy ra trước khi nấu [26].
Có nhiều phương pháp xác định B.cereus gây ngộ độc thực phẩm:
o Phương pháp định danh kinh điển dựa vào việc phân lập và các đặc tính sinh hóa, sinh lý của B.cereus. Tuy nhiên phương pháp này chỉ xác định thực phẩm có hay không có B. cereus mà không phát hiện được các thực phẩm đó có độc tố hay không. o Phương pháp ELISA có thể sử dụng để phát hiện độc tố trong thực phẩm, tuy nhiên đây chỉ là phương pháp gián tiếp nên độ nhạy không cao [13]. o Phương pháp sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử như phản ứng khuyếch đại gen – Polymerase Chain Reaction (PCR) đang được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu và chẩn đoán lâm sàng cũng như trong chẩn đoán các tác nhân gây ngộ độc có trong thực phẩm. Phương pháp này cho phép xác định chính xác được sự ô nhiễm của thực phẩm với các chủng vi khuẩn gây bệnh thông qua sự có mặt của các đoạn gen đặc hiệu của vi khuẩn gây bệnh.Ưu điểm của kỹ thuật này là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tiết kiệm thời gian, kể cả nguyên vật liệu. Ở Việt Nam đã có một vài nghiên cứu được công bố về việc sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện căn nguyên gây ngộ độc thực phẩm của các vi khuẩn như S.aureus, E. coli O157, Salmonella…. nhưng chưa đề cập đến việc xác định các gen gây độc của B.cereus trong thực phẩm.
Việt Nam là nước có điều kiện khí hậu nóng ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho B.cereus phát triển trong thực phẩm và giải phóng ra độc tố, ý thức của người dân chưa đầy    đủ và    đặc    biệt    là    việc    sử    dụng    rất    nhiều    các    sản    phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ gạo làm cho tỷ lệ ngộ độc thực phẩm do B. cereus là không nhỏ ở Việt Nam do đó việc nghiên cứu áp dụng một kỹ thuật với nhiều cặp mồi có độ nhạy, độ đặc hiệu cao nhằm phát hiện các gen đặc hiệu của B.cereus gây ngộ độc thực phẩm trong một phản ứng để tiết kiệm thời gian và kinh phí là hết sức cần thiết và có ý nghĩa thiết thực, giúp nghiên cứu sâu hơn về căn nguyên gây ngộ độc thực phẩm do B.cereus. Để góp phần kiểm soát VSATTP, giảm chi phí xã hội thông qua việc ngăn ngừa các vụ ngộ độc thực phẩm do B.cereus và nâng cao năng lực kiểm soát VSATTP của các cơ quan chức năng. Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện gen độc tố của B.cereus trong thực phẩm bằng kỹ thuật Multiplex PCR“
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1.     Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện gen độc tố B.cereus bằng kỹ thuật Multiplex-PCR ở quy mô phòng thí nghiệm.
2.     Thử nghiệm quy trình trên để phát hiện gen độc tố của B.cereus trong một số thực phẩm có nguồn từ gạo tại Hà nội.
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ    1
CHƯƠNG 1 :TỔNG QUAN    4
1.1.    TÌNH HÌNH VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM    4
1.1.1    Trên thế giới    4
1.1.2    Ở Việt Nam    5
1.2    VÀI NÉT VỀ BACILLUS CEREUS    6
1.2.1    Các nghiên cứu về B. cereus    6
1.2.2    Một số hình ảnh của B.cereus        7
1.2.3    Đặc tính sinh học của B.cereus    9
1.2.4    Triệu chứng lâm sàng    13
1.2.5    Các phương pháp chẩn đoán :    14
1.2.6    Điều trị    17
1.2.7    Phòng bệnh    18
1.2.8    Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu về B.cereus    18
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU    22
2.1    ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU    22
2.1.1.    Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 1    22
2.1.2.    Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 2    22
2.2    VẬT LIỆU VÀ DỤNG CỤ    23
2.2.1    Sinh phẩm, hoá chất, dụng cụ và máy móc dùng trong kỹ thuật PCR và
giải trình tự gen    23
2.2.2    Vật liệu dùng cho nuôi cấy và xác định vi khuẩn    24
2.3.    PHƯƠNG PHÁP    25
2.3.1.    Phương pháp nghiên cứu cho mục tiêu 1    25
2.3.2.    Phương pháp nghiên cứu cho mục tiêu 2    29
2.4.    GIẢI TRÌNH TỰ GEN    35
2.4.1.    Khuếch đại các đoạn gen bằng kỹ thuật PCR đơn mồi    35
2.4.2.    Tinh sạch các sản phẩm PCR    35
2.4.3.    PCR giải trình tự    35
2.4.4.    Đọc trình tự gen bằng máy đọc trình tự ABI     36
2.4.5.    So sánh các đoạn gen và được so sánh với các trình tự chuẩn của ngân
hàng gen    36
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU    37
3.1.    XÂY DỰNG QUI TRÌNH MULTIPLEX PCR    37
3.1.1.    Xây dựng qui trình trên chủng B.cereus chuẩn ATCC4342    37
3.1.2.    Thử nghiệm qui trình trên thực phẩm gây nhiễm thực nghiệm    38
3.2.    KẾT QỦA ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR ĐỂ PHÁT
HIỆN TRỰC TIẾP GEN ĐỘC TỐ B.CEREUS TRÊN MỘT SỐ THỰC PHẨM TẠI HÀ NỘI     40
3.3.    KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN    46
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN    50
4.1.    XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN GEN ĐỘC TỐ CỦA
B.CEREUS TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR VỚI QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM    51
4.2    ỨNG DỤNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN GEN ĐỘC TỐ CỦA
B.CEREUS TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR TRÊN MỘT SỐ THỰC PHẨM    52
4.3    XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHƯƠNG PHÁP
MULTIPLEX -PCR    56
4.3.1    Xác định độ nhạy của phương pháp Multiplex-PCR    56
4.3.2    Xác định độ đặc hiệu của phương pháp Multiplex-PCR    56
4.4.    GIẢI TRÌNH TỰ GEN    57
KẾT LUẬN    59
KIẾN NGHỊ    60
TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC