Nghiên cứu, xây dựng quy trình tách, bảo quản DNA và lymphocyte người Mường

Xuất phát từ nhu cầu cần có DNA và lymphocyte để phục vụ cho một số công trình nghiên cứu trước mắt và lâu dài về “Đặc điểm sinh học và bệnh lý của các gen bình thường và bệnh lý ở một số dân tộc nước ta”, bảo quản DNA phục vụ cho quỹ gen (Gene Bank), chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu, xây dựng quy trình tách, bảo quản DNA và lymphocyte người Mường” với 2 mục tiêu:

– Hoàn chỉnh kỹ thuật chiết tách DNA, tách và bảo quản lymphocyte từ máu ngoại vi trong điều kiện trang thiết bị hiện có.

– Chiết tách, bảo quản DNA của một số con em dân tộc Mường tỉnh Hoà Bình.

1.1. Đóng góp mới của đê tài:

DNA có trong hầu hết tế bào của các mô ở dạng tươi hoặc bảo quản (máu, gan, lách, hạch, xương, tóc, móng tay chân .ấể) trong các dịch sinh học (huyết thanh, dịch não tuỷ, nước ối và các dịch tiết khác), tồn tại lâu trong các mẫu vật. Tuỳ theo nguyên liệu, tuỳ theo yêu cầu và mục đích sử dụng mà áp dụng các phương pháp chiết tách khác nhau.

Ớ người, DNA có nhiều trong nhân và ty lạp thể của các tế bào có nhân. Bạch cầu máu ngoại vi: vừa phong phú DNA, vừa dễ dàng lấy —> là nguyên liệu khá thuận lợi cho việc chiết tách để phục vụ đề tài nghiên cứu tính đa dạng gen học của con người và bảo quản lưu giữ ế

1.1.1. Chọn phương pháp kỹ thuật chiết tách DNA từ bạch cầu máu ngoại Vỉắ; Căn cứ vào trang thiết bị hiện có, các hoá chất sẵn có dễ nhập, dựa

vào tài liệu của hội thảo quốc tế về hoà hợp mô lần thứ XIII năm 2002 tại Seattle (Mỹ) chúng tôi chọn phương pháp Phenol/Chloroform, Salting out. Phương pháp dùng muối trimethylammonium bromide và dùng kit QIA amp mà hội thảo nêu ra: không nhập được hoá chất, kít quá đắt nên không thể triển khai. 

Từ các kết quả thu được về mật độ quang (OD) và điện di trên thạch agarose 0,7% thì phương pháp Salting out cải tiến đáp ứng yêu cầu về chất lượng DNA (OD 26O/OD 280 = 1,81; điện di cho một vạch).

Phương pháp này được sử dụng chiết tách DNA bạch cầu máu ngoại vi của 107 người Mường và cũng được áp dụng để chiết tách DNA của người Thái tại Sơn La (Dự án của GS. Vũ Triệu An).

Sau một năm bảo quản ở -70°c, chất lượng của DNA vãn xấp xỉ như khi mới chiết tách.

7.7.2. Hoàn chỉnh phương phấp kỹ thuật tách, bảo quản lymphocyte:

– Tách lymphocyte bằng Ficoll.

– Bảo quản lymphocyte theo 2 quy trình: Bằng máy Nicool-10 và Nitơ

lỏng.

/ằ2. Kết quả cụ thể:

– Chọn được phương pháp chiết tách DNA phù hợp với điều kiện thực tếễ

– Bằng điều tra, phỏng vấn trực tiếp đã chọn được 107 người Mường trong tổng số gần 420 học sinh trường phổ thông dân tộc tỉnh Hoà Bình.

– Bảo quản được 107 mẫu DNA của người Mường có chất lượng tốt, đáp ứng với kỹ thuật PCR: sau 1 năm bảo quản ở -70°c, chất lượng và số lượng DNA vẫn xấp xỉ với khi mới chiết tách, hiện vãn bảo quản.

– DNA tách được đã sử dụng:

+ Nghiên cứu đột biến gen G6PD, các kháng nguyên HLA của các đối tượng thiếu G6PD (phục vụ dự án của GS. Vũ Triệu An và PGS.TS Trần Thị Chính) đểề. Phát hiện các đột biến gen G6PD của các trường hợp thiếu enzym G6PD, tần suất của các kháng nguyên HLA chủ yếu của các đối tượng thiếu G6PD.

+ Phân tích alen của các locus D5S8181, D7S820, D13S317 bằng kỹ thuật PCR-STR phát hiện các đoạn Nucleotid lặp lại ngắn.

+ DNA bảo quản: Nguyên liệu nghiên cứu tính đa dạng gen học của một số sắc tộc nước ta, tần suất các gen hay gặp. Bảo quản lưu giữ DNA phục vụ cho dự án “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và bệnh lý của các gen bình thường và gen bệnh của một số dân tộc nước ta”.

– Bảo quản lymphocyte trong Nitơ lỏng: Sau 1 tháng, tỷ lệ lymphocyte sống 50%.

1.3. Hiệu quả vê đào tạo:

– Một luận văn tốt nghiệp bác sĩ y khoa.

– Cung cấp thêm một số huyết thanh người Mường cho học viên cao học nghiên cứu.

1.4. Hiệu quả kinh tế:

Nghiên cứu thuộc lĩnh vực cơ bản, do vậy không tính được hiệu quả kinh tế cụ thể.

1.5. Hiệu quả về xã hội:

– Làm được một số xét nghiệm: Phát hiện ký sinh trùng sốt rét, phát hiện các trường hợp thiếu enzym G6PD, phát hiện những người mang kháng nguyên viêm gan B để có những lời khuyên về phòng bệnh cho họ.

– Tiêm phòng viêm gan B cho 107 học sinh có HBsAg (-), anti HBsAg (-) bằng vacxin Engerix B, đủ liều và đúng quy trình tiêm chủng. Kết quả: sau 3 lần tiêm vacxin, 87% có đáp ứng tạo kháng thể chống viêm

gan ở mức tốt (> 10mƯI/ml): có khả năng phòng bệnh viêm gan B.

y.ốỂ Các hiệu quả khác:

– Cung cấp DNA cho 3 đề tài nghiên cứu.

– Giữ DNA người Mường phục vụ cho dự án “Nghiên cứu về đặc điểm sinh học và bệnh lý của các gen bình thường và gen bệnh của một số dân tộc”.

2) Áp dụng cho thực tiễn:

Quy trình phương pháp Salting out chiết tách DNA đã được ứng dụng để chiết tách DNA của người Thái tại Sơn La và sẽ ứng dụng chiết tách DNA người Tày, Nùng tại Cao Bằng vào tháng 2 năm 2004.

Bảo quản DNA ở -70°c trong điều kiện nước ta là phù hợp. Lymphocyte: Có thể lun giữ trong một thời gian cần thiết bằng Nitơ

lỏng.

3) Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đê cương nghiên cứu đã được phê duyệt.

3ệl. Tiến độ:

+ Ngày 10 tháng 06 năm 2002, Bộ trưởng Bộ Y tế phê duyệt đề tài (QĐ số 2212/QĐ-BYT).

+ Tháng 7 năm 2002 được phân bổ kinh phí nghiên cứu.

+ Tháng 8 năm 2002 đến tháng 9 năm 2003 triển khai nghiên cứu: Hoàn chỉnh lựa chọn kỹ thuật và triển khai tại thực địa (tỉnh Hoà Bình).

+ Tháng 10 đến tháng 12 năm 2003 viết báo cáo nghiệm thu.

Đảm bảo đúng tiến độ.

3.2. Thực hiện mục tiêu nghiên cứu:

Thực hiện đầy đủ 2 mục tiêu đề raẵ

3.3. Sản phẩm tạo ra so với dự kiến của đê cương:

Đủ số lượng, chất lượng cũng như việc bảo quản DNA như bản đề cương dự kiến.

Giữ được lymphocyte trong Nitơ lỏng với tỷ lệ sống 50% đúng với yêu cầu khoa học dự kiến của đề cương.

4) Đánh giá việc sử dụng kinh phí:

+ Tổng kinh phí được duyệt cấp: 100.000.000d + Kinh phí sự nghiệp khoa học cấp 100%

+ Toàn bộ kinh phí đã, đang được thanh toán và sẽ quyết toán kết thúc cùng với nghiệm thu vào cuối tháng 12 năm 2003 ế

5) Các ý kiến đề xuất:

– Với kinh phí như được cấp thì chỉ thực hiện được các đề tài khoa học ở các cơ sở đã có sẵn trang thiết bịẵ

– Vì sự phát triển và hiệu quả to lớn của công nghệ sinh học, đề nghị các cơ quan quản lý khoa học công nghệ cho nhập các máy móc phục vụ các đề tài nghiên cứu ở mức phân tử như máy PCR, phân tích trình tự (Sequence) và các thiết bị máy móc phụ trợ ..ễ, đào tạo chuyển giao kỹ thuật sinh học phân tử cho các cán bộ trẻ.

MỤC LỤC

MỤC LỤC

PHAN A. Tóm tắt các kết quả chính của đề tài 1

PHAN B. Nội dung báo cáo chi tiết kết quả nghiên cứu 5

1. ĐẬT VÂN ĐỀ 5

2. TỔNG QUAN 7

2ềl. DNA 7

2.1.1. Cấu trúc khái quát của DNA 7 2.1.2ẳ Một số dạng DNA 8

2.1.3. Một số tính chất quan trọng của DNA 9

2.1.4. DNA tham gia cấu tạo Chromosom 10

2.1.5. Tổng hợp acid deoxyribonucleic 11

2.2. Chiết tách, tinh khiết, bảo quản DNA 12

2.2.1. Nguyên liệu chiết tách DNA 12 2.2.2ẵ Chiết tách DNA từ bạch cầu 13

2.2.3. Chiết tách DNA từ tế bào của các mô 14 2.2.4ẳ Chiết tách DNA từ huyết thanh 15

2.3. Sử dụng DNA chiết tách 15

2.4. Lymphocyte 16

3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 17

3.1. Đối tượng nghiên cứu 17

3.1.1. Đối tượng chiết tách DNA 17

3.1.2. Đối tượng tách, bảo quản lymphocyte 17

3.2. Phương pháp nghiên cứu 18

3.2.1. Quy trình kỹ thuật chiết tách DN A từ bạch cầu 18

3ẵ2.2. Kỹ thuật tách, bảo quản lymphocyte 23

3.2ề3ề Các xét nghiệm phụ trợ khác 24

3.2.4. Xử lý số liệu 24 

4. KẾT QUẢ NGHIÊN cứu 25

4.1ệ Hoàn chỉnh kỹ thuật 25

4.1.1. Hoàn chỉnh kỹ thuật chiết tách DNA 25

4.1.2. Tách lymphocyte 27

4.2. Kết quả nghiên cứu 28

4.2.1. Kết quả kiểm tra lymphocyte sau khi bảo quản 28 4.2ễ2. Kết quả chiết tách DNA người Mường 29

4.2.3. Kết quả kiểm tra DNA sau 12 tháng bảo quản ở -70°c 29 4.3Ễ Kết quả các xét nghiệm phụ trợ 30

4.3.1. Tỷ lệ mang HBsAg(+) 30

4.3.2. Đáp ứng với vacxin chống HBV (Engerix-B) 31 4ẽ3.3. Tỷ lệ mang ký sinh trùng sốt rét 32

4.3.4. Tỷ lệ thiếu enzym G6PD 32

4.4. Sử dụng DNA chiết được của dân tộc Mường 33

5. BÀN LUẬN

5.1. Tách và bảo quản lymphocyte 34

5.2. Chiết tách, bảo quản DNA 36