Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid

Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid.Berberin là một hóa dược phổ biến dùng để sản xuất thuốc cho điều trị các bệnh liên quan đến nhiễm khuẩn đường ruột và ức chế tình trạng kích thích co thắt nhu động ruột. Berberin được sử dụng rộng rãi tại Việt Nam từ những năm 1960 làm thuốc chữa lỵ và nhiễm khuẩn đường ruột. Ngoài ra, berberin còn có trong thành phần của một số loại thuốc khác như thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do tác nhân kích thích bên ngoài và thuốc điều trị bệnh đau mắt hột. Hiện nay, rất nhiều tác dụng khác của berberin được nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng như giúp ngăn ngừa nhiễm nấm, bội nhiễm nấm và chống lại tác hại của vi khuẩn tả, hạ đường huyết, làm giảm mạnh lượng cholesterol, triglycerid và xơ vữa, nhưng không gây ra tác dụng phụ điển hình như các statin. Berberin ngăn chặn sự phát triển của nhiều loại tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của các tế bào bình thường [89]. Ngoài ra, berberin còn có tác dụng bảo vệ tim mạch, đồng thời có tác dụng chống trầm cảm

Nhu cầu về berberin ngày càng tăng. Tại Việt Nam, nhu cầu sử dụng berberin cũng rất lớn. Trên thế giới ngành công nghiệp dược đang phải đối mặt với việc khai thác tràn lan quá mức các loại dược liệu mà chưa có chiến lược bảo tồn hợp lý, nguồn nguyên liệu chiết xuất berberin đang đứng trước nguy cơ cạn kiệt [1]. Việc canh tác truyền thống tại các vùng trồng dược liệu chứa berberin hiện nay cũng không đáp ứng được nhu cầu của thị trường thuốc hiện tại [6], [8]. Trên thế giới, các quốc gia như
Nhật Bản, Trung Quốc đã tổng hợp và thương mại hóa chế phẩm berberin tổng hợp từ rất lâu. Các nghiên cứu tổng hợp berberin đã được các nhà khoa học trên thế giới phát triển trong nhiều thập kỉ nay. Chúng tôi thấy rằng sản xuất berberin bằng con
đường tổng hợp hóa học nhằm đảm bảo sự ổn định, bền vững nguồn nguyên liệu là rất triển vọng và thiết thực. Vì vậy, chúng tôi thực hiện luận án “Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid” với 2 mục tiêu sau:
1. Xây dựng được quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô 500g/mẻ đạt tiêu chuẩn dược dụng.
2. Đánh giá được độc tính cấp và độ ổn định của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ………………………………1
DANH MỤC CÁC BẢNG ………………………………………………………………………..3
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ ………………………………………………………6
ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………………………………….1
Chương 1. TỔNG QUAN……………………………………………………………………….2
1.1. Khái quát chung về berberin clorid ………………………………………………..2
1.1.1. Đặc điểm cấu trúc hóa học………………………………………………………….2
1.1.2. Tính chất hóa lý ………………………………………………………………………..3
1.1.3. Ứng dụng trong lâm sàng……………………………………………………………4
1.1.4. Tác dụng dược lý ………………………………………………………………………5
1.2. Phương pháp sản xuất berberin ……………………………………………………..9
1.2.1. Phương pháp chiết xuất từ dược liệu ……………………………………………9
1.2.2. Phương pháp tổng hợp hóa học …………………………………………………10
1.3. Phân tích và lựa chọn phương pháp tổng hợp berebrin …………………20
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………….23
2.1. Nguyên liệu, thiết bị ……………………………………………………………………..23
2.1.1. Nguyên liệu…………………………………………………………………………….23
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ ……………………………………………………………………..24
2.2. Nội dung nghiên cứu…………………………………………………………………….26
2.3. Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………………………..26
2.3.1. Tổng hợp hóa học và tinh chế sản phẩm, khảo sát các thông số tối ưu
……………………………………………………………………………………………………….26
2.3.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết……………………………………………28
2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học……………………………………..28
2.3.4. Phương pháp đánh giá chất lượng nguyên liệu berberin clorid………28
2.3.5. Phương pháp nghiên cứu độ ổn định của nguyên liệu tổng hợp được
……………………………………………………………………………………………………….29
2.3.6. Phương pháp thử độc tính cấp của nguyên liệu tổng hợp được ……..30
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ………………………………………………323.1. Xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô phòng thí nghiệm
……………………………………………………………………………………………………..32
3.1.1. Phương pháp tổng hợp berberin clorid thông qua trung gian
homopiperonylamin hydroclorid ………………………………………………………..32
3.1.2. Phương pháp mới tổng hợp berberin clorid từ 2,3-
dimethoxybenzaldehyd qua chất trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim…52
3.1.3. So sánh các phương pháp tổng hợp berberin clorid ở quy mô phòng thí
nghiệm…………………………………………………………………………………………….56
3.2. Kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc hóa học của các chất
tổng hợp được……………………………………………………………………………….56
3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết ……………………………………………………………….56
3.2.2. Khẳng định cấu trúc sản phẩm tổng hợp được …………………………….58
3.3. Xây dựng quy trình tinh chế berberin clorid quy mô phòng thí nghiệm
đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V ……………………………………………65
3.3.1. Quy trình tiến hành ………………………………………………………………….65
3.3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng………………………………………………….65
3.3.3. Đánh giá chất lượng sản phẩm tinh chế theo tiêu chuẩn DĐVN V…66
3.4. Xây dựng quy trình tổng hợp và tinh chế berberin clorid quy mô 100
g/mẻ………………………………………………………………………………………………68
3.4.1 Tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal ………..68
3.4.2. Tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) từ 3,4-methylendioxy-
β-nitrostyren (61) ……………………………………………………………………………..68
3.4.3. Tổng hợp 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-
dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) từ homopiperonylamin
hydroclorid (6a) ……………………………………………………………………………….75
3.4.4. Tổng hợp berberin (1) từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-
dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) ……………………………….76
3.4.5. Tinh chế sản phẩm berberin thô đạt tiêu chuẩn theo Dược điển Việt
Nam V ở quy mô 100 g/mẻ………………………………………………………………..77
3.5. Xây dựng quy trình tổng hợp và tinh chế berberin clorid quy mô 500
g/mẻ………………………………………………………………………………………………803.5.1. Giai đoạn 1 – tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ
piperonal …………………………………………………………………………………………80
3.5.2. Giai đoạn 2 – tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) từ 3,4-
methylendioxy-β-nitrostyren (61) với tác nhân khử Fe………………………….83
3.5.3. Giai đoạn 3 – tổng hợp 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-
dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) từ homopiperonylamin
hydroclorid (6a) ……………………………………………………………………………….86
3.5.5. Giai đoạn 4 – tổng hợp berberin (1) từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-
(2,3-dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31)…………………………89
3.5.6. Tinh chế sản phẩm berberin quy mô 500g/mẻ …………………………….92
3.6. Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu berberin clorid tổng hợp..94
3.7. Kết quả nghiên cứu độ ổn định và thử độc tính cấp của nguyên liệu
berberin tổng hợp………………………………………………………………………….97
3.7.1. Kết quả nghiên cứu độ ổn định………………………………………………….97
3.7.2. Kết quả thử độc tính cấp của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được
……………………………………………………………………………………………………..101
Chương 4. BÀN LUẬN……………………………………………………………………….111
4.1. Một số bàn luận về quy trình tổng hợp………………………………………..111
4.1.1. Về quy trình tổng hợp quy mô thí nghiệm…………………………………111
4.1.2. Về phương pháp tổng hợp berberin mới……………………………………116
4.1.3. Về quy trình tổng hợp quy mô 500g/mẻ……………………………………121
4.2. Bàn luận về quá trình tổng hợp hóa học, tinh chế và độ ổn định của
nguyên liệu berberin clorid tổng hợp được …………………………………..127
4.2.1. Về các quá trình tổng hợp chất trung gian và sản phẩm cuối……….127
4.2.2. Cấu trúc hóa học của các hợp chất tổng hợp được……………………..139
4.3. Về độ ổn định của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được ………..144
4.5. Về tiêu chuẩn chất lượng của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được
……………………………………………………………………………………………………148
4.6. Về độc tính cấp của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được ……..148
Kết luận Và kiến nghị …………………………………………………………………………..15

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Danh mục dung môi, hóa chất …………………………………………………………23
Bảng 2.2. Danh mục thiết bị, dụng cụ……………………………………………………………..24
Bảng 3.1 Kết quả tổng hợp chất 61 theo 2 phương pháp……………………………………35
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol nitromethan/piperonal tới hiệu
suất phản ứng ……………………………………………………………………………………….35
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất phản ứng…………36
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất phản ứng………..37
Bảng 3.5 Kết quả tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) theo 5 phương pháp
……………………………………………………………………………………………………………42
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol giữa NaBH4 và 3,4-
methylendioxy-β-nitrostyren (61) đến hiệu suất phản ứng………………………….43
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của xúc tác cho phản ứng khử hóa……………44
Bảng 3.8 Kết quả tổng hợp chất 31 theo 2 phương pháp……………………………………46
Bảng 3.9 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol giữa aldehyd và chất 6a……….47
Bảng 3.10 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các bazơ khác nhau đến hiệu suất phản
ứng ngưng tụ ………………………………………………………………………………………..47
Bảng 3.11 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất phản ứng………48
Bảng 3.12 Kết quả tổng hợp berberin clorid (1) theo 2 phương pháp ………………….50
Bảng 3.13 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol đến hiệu suất phản ứng …………………50
Bảng 3.14 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng …………………51
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân khử hóa đến hiệu suất phản
ứng tổng hợp 63 ……………………………………………………………………………………54
Bảng 3.16. So sánh các phương pháp tổng hợp berberin clorid từ các nguyên liệu
khác nhau …………………………………………………………………………………………….56
Bảng 3.17 Đặc điểm sắc ký lớp mỏng của các hợp chất tổng hợp được ………………56
Bảng 3.18 Nhiệt độ nóng chảy của các hợp chất tổng hợp được…………………………57
Bảng 3.19 Kết quả phân tích cấu trúc 61 …………………………………………………………58
Bảng 3.20 Kết quả phân tích cấu trúc 62 …………………………………………………………59
Bảng 3.21 Kết quả phân tích cấu trúc 63 …………………………………………………………60
Bảng 3.22 Kết quả phân tích cấu trúc 25a ……………………………………………………….61
Bảng 3.23 Kết quả phân tích cấu trúc 6a …………………………………………………………62
Bảng 3.24 Kết quả phân tích cấu trúc 31 …………………………………………………………63
Bảng 3.25 Kết quả phân tích cấu trúc 1 …………………………………………………………..64
Bảng 3.26 Ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất kết tinh Berberin clorid ………….66Bảng 3.27 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quy trình tinh chế………………………………….66
Bảng 3.28 Kết quả kiểm nghiệm berberin clorid theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam
V…………………………………………………………………………………………………………67
Bảng 3.29 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 61 với tác nhân
NaOH ở quy mô 100 g/mẻ……………………………………………………………………..68
Bảng 3.30 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 6a ………………..69
Bảng 3.31 Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng ………………………………………………..71
Bảng 3.32 Kết quả khảo sát tỷ lệ mol chất 61 : sắt……………………………………………72
Bảng 3.33 Kết quả khảo sát thời gian phản ứng ……………………………………………….72
Bảng 3.34 Kết quả khảo sát dung môi …………………………………………………………….73
Bảng 3.35 Kết quả khảo sát tỷ lệ alcol : nước…………………………………………………..73
Bảng 3.36 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình cải tiến tổng hợp chất 6a quy mô
100g/mẻ……………………………………………………………………………………………….74
Bảng 3.37 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 31 ………………..76
Bảng 3.38 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô
100 g/mẻ………………………………………………………………………………………………77
Bảng 3.39 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tinh chế chất 1 …………………..77
Bảng 3.40 Kết quả kiểm nghiệm berberin clorid theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam
V…………………………………………………………………………………………………………79
Bảng 3.41 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 61 với tác nhân
NaOH ở quy mô 500 g/mẻ……………………………………………………………………..81
Bảng 3.42 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 6a bằng quy trình
cải tiến sử dụng bột sắt ở quy mô 500 g/mẻ ……………………………………………..84
Bảng 3.43 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 31 ở quy mô 500
g/mẻ…………………………………………………………………………………………………….86
Bảng 3.44 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 1 ở quy mô 500
g/mẻ…………………………………………………………………………………………………….89
Bảng 3.45 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tinh chế chất 1 …………………..92
Bảng 3.46 Tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu berberin clorid tổng hợp ……………….95
Bảng 3.47 Kết quả kiểm nghiệm nguyên liệu berberin clorid tổng hợp được ở quy mô
500g/mẻ……………………………………………………………………………………………….96
Bảng 3.48 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1A ở điều kiện
lão hóa cấp tốc ……………………………………………………………………………………..98
Bảng 3.49 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1B ở điều kiện
lão hóa cấp tốc ……………………………………………………………………………………..98Bảng 3.50 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1C ở điều kiện
lão hóa cấp tốc ……………………………………………………………………………………..99
Bảng 3.51 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1A ở điều kiện
dài hạn……………………………………………………………………………………………….100
Bảng 3.52 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1B ở điều kiện
dài hạn……………………………………………………………………………………………….100
Bảng 3.53 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1C ở điều kiện
dài hạn……………………………………………………………………………………………….100
Bảng 3.54 Mô tả tình trạng chuột ở các lô sau dùng mẫu thử nguyên liệu berberin
clorid – mẫu 1……………………………………………………………………………………..102
Bảng 3.55 Số chuột chết ở các lô trong vòng 72 giờ sau khi uống nguyên liệu berberin
chlorid ……………………………………………………………………………………………….108
Bảng 3.56 Tỉ lệ chết chuột nhắt trắng và giá trị LD50 của mẫu thử nguyên liệu berberin
chlorid ……………………………………………………………………………………………….109
Bảng 4.1. Những cải tiến trong nâng cấp quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô
500g…………………………………………………………………………………………………..121
Bảng 4.2 Các phương pháp tổng hợp berberin clorid thông qua hợp chất trung gian 6
………………………………………………………………………………………………………….126
Bảng 4.3 Kết quả so sánh phổ 1H-NMR berberin tổng hợp được và phổ chuẩn của
berberin clorid…………………………………………………………………………………….143
Bảng 4.4 Kết quả so sánh phổ 13C-NMR berberin tổng hợp được và phổ chuẩn của
berberin clorid…………………………………………………………………………………….143
Bảng 4.5 Tổng hợp giá trị LD50 của nguyên liệu berberin………………………………..15

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
Hình 1.1. Con đường sinh tổng hợp berberin …………………………………………………….2
Hình 1.2. Phản ứng khử berberin ……………………………………………………………………..4
Hình 1.3. Phản ứng thủy phân berberin trong môi trường kiềm……………………………4
Hình 1.4. Sơ đồ tổng hợp berberin của Amé Pictet và Alfons Gams …………………..10
Hình 1.5. Sơ đồ tổng hợp berberin của T. Kametani và cộng sự…………………………11
Hình 1.6. Sơ đồ tổng hợp berberin của Viện Y học cổ truyền Trung Quốc ………….12
Hình 1.7. Sơ đồ tổng hợp berberin của W. Liu…………………………………………………13
Hình 1.8. Sơ đồ tổng hợp berberin của Z. X. Chen …………………………………………..14
Hình 1.9. Sơ đồ tổng hợp berberin của Xiaolin Bian (2006) và Peng Yang (2008).15
Hình 1.10. Sơ đồ tổng hợp berberin của Alice Gatland……………………………………..16
Hình 1.11. Sơ đồ tổng hợp berberin của Virshinha Reddy…………………………………17
Hình 1.12. Sơ đồ tổng hợp berberin của Chen Cheng ……………………………………….18
Hình 1.13. Sơ đồ tổng hợp berberin của Chen Cheng ……………………………………….19
Hình 1.14. Sơ đồ tổng hợp berberin qua hợp chất trung gian 6a (dạng muối
hydroclorid của amin 6)…………………………………………………………………………20
Hình 1.15. Sơ đồ phân tích tổng hợp ngược berberin từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd
……………………………………………………………………………………………………………22
Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp berberin clorid từ vanilin ………………………………………….27
Hình 2.2. Sơ đồ tổng hợp berberin từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd qua chất trung gian
2,3-dimethoxybenzaldoxim (62)……………………………………………………………..27
Hình 3.1. Sơ đồ tổng hợp berberin từ piperonal quy mô phòng thí nghiệm…………52
Hình 3.2. Sơ đồ tổng hợp berberin từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd qua chất trung gian
2,3-dimethoxybenzaldoxim ……………………………………………………………………52
Hình 3.3. Sơ đồ quy trình tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ
piperonal ……………………………………………………………………………………………..82
Hình 3.4. Sơ đồ quy trình tổng hợp 6a từ 61 …………………………………………………..85
Hình 3.5. Sơ đồ quy trình tổng hợp amin 31 từ amin 6a …………………………………..88
Hình 3.6. Sơ đồ quy trình tổng hợp berberin clorid (1) từ amin 31……………………..91
Hình 3.7. Sơ đồ quy trình tinh chế berberin clorid …………………………………………..93
Hình 3.8. Sơ đồ quy trình tinh chế berberin clorid ……………………………………………94
Hình 3.9. Đồ thị dự đoán tuổi thọ của nguyên liệu berberin clorid ở điều kiện dài
hạn…………………………………………………………………………………………………….101
Hình 4.1. Sơ đồ tóm tắt các phương pháp tổng hợp berberin qua chất trung gian amin
(6)……………………………………………………………………………………………………..112Hình 4.2. Các phương pháp tổng hợp homopiperonylamin………………………………114
Hình 4.3. Cơ chế phản ứng hình thành 2,3-dimethoxybenzaldoxim (62) từ 2,3-
dimethoxybenzaldehyd ………………………………………………………………………..118
Hình 4.4 Cơ chế phản ứng demethyl vanilin bằng AlCl3/pyridin………………………128
Hình 4.5. Cơ chế phản ứng đóng vòng methylenoxyd của 25a …………………………129
Hình 4.6. Cơ chế phản ứng ngưng tụ piperonal và nitromethan………………………..130
Hình 4.7. Quá trình khử hóa nitrostyren 61 thành muối amin 6a sử dụng hệ khử
NaBH4/CuCl2 ……………………………………………………………………………………..131
Hình 4.8. Cơ chế phản ứng khử nối đôi trong phân tử 61 bằng NaBH4 ……………..132
Hình 4.9. Cơ chế phản ứng hình thành 31 từ (6a)……………………………………………136
Hình 4.10. Cơ chế phản ứng hình thành berberin clorid (1) từ 31……………………..138
Hình 4.11. Sắc ký đồ HPLC sản phẩm berberin clorid…………………………………….145
Hình 4.12. DSC mẫu berberin clorid bán trên thị trường …………………………………146
Hình 4.13. DSC mẫu berberin clorid tổng hợp được ……………………………………….14