Nuôi cấy và biệt hóa tế bào gốc trung mô tủy xương người thành nguyên bào xương trên giá thể san hô in vitro

Vật liệu sinh học ngày nay được sử dụng khá phổ biến trong y học. Trong lĩnh vực chấn thương chỉnh hình thì những bệnh lý khuyết xương có thể điều trị bằng mô ghép tự thân, mô ghép đồng    loại, mô ghép    dị    loại,    các    vật    liệu    có nguồn    gốc polymer,    gốm,    thủy    tinh sinh học.. .Tuy nhiên, yêu cầu chung của các loại vật liệu trên là cần có độ bền cơ học cao và hạn chế đến mức thấp nhất việc kích ứng phản ứng miễn dịch của cơ thể (3).
Do đó, vấn đề nghiên cứu và phát triển ra những loại vật liệu ghép mới có khả năng thoái biến sinh học và kích ứng tạo xương trở nên cấp thiết để điều trị những bệnh lý về xương một cách hiệu quả (7, 17).
Một trong những loại vật liệu sinh học được sử dụng rất nhiều trong ghép điều trị bệnh lý tổn thương xương hiện nay là san hô tự nhiên . San hô đã được nghiên cứu và ứng dụng ghép trong những bệnh lý tổn thương xương, răng hàm mặt, nhãn khoa (8, 10, 11)…Tuy nhiên, trong nhiều năm qua san hô được sử dụng như là một giá thể để kích thích tạo xương, là vật liệu sinh học không mang tế bào.
Do đó, để nâng cao hiệu quả ứng dụng của mảnh ghép san hô, chúng tôi tiến hành nghiên cứu nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ tủy xương và biệt hóa thành nguyên bào xương trên giá thể san hô nhằm tạo ra một loại vật liệu mới có thể mang được tế bào ghép (4, 5, 6, 7, 16), hướng đến sử dụng mảnh ghép san hô điều trị trong những bệnh lý tổn thương xương.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu : Thí nghiệm thực nghiệm mô tả Đối tượng nghiên cứu :
Tủy xương    lấy    từ    người    hiến    tình nguyện    ở Bệnh    viện    Chấn    Thương Chỉnh Hình
TP.HCM.
San hô tự nhiên (Porites lutea) được thu nhận từ viện Hải Dương Học Nha Trang. Phương pháp nghiên cứu:
Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc trung mô tủy xương người (2, 13, 14)
Mỗi lần thu nhận khoảng 2ml tủy xương người trong tube đã chứa khoảng 300mL heparin để chống đông. Tế bào đơn nhân từ tủy xương được tách bằng phương pháp ly tâm đẳng tỷ trọng với dung dịch Ficoll-Paque (Amersham, freiburg Germany). Dịch tế bào đơn nhân được đánh giá tỉ lệ % tế bào sống bằng cách nhuộm với dung dịch trypan blue.
Tế bào được nuôi trong chai nuôi ở mật độ khoảng 105-106 tế bào/ml với 5ml môi trường IMDM (Gibco), 15% FBS và kháng sinh penicilin, streptomycin. Các chai nuôi được ủ trong tủ ấm ở 370C, 5%CO2. Môi trường được thay mới mỗi 3 ngày/ 1 lần.
Xác định dòng tế bào gốc trung mô từ tủy xương sau nuôi cấy
Sau khi nuôi cấy in vitro, tế bào được cố định bằng dung dịch và nhuộm hóa mô miễn dịch huỳnh quang với 2 marker desmin và vimentin. Kháng thể đơn dòng kháng-Desmin thu từ chuột (Sigma-Aldrich: D1033 clone DE-U-10) và kháng thể đơn dòng kháng-Vimentin thu từ chuột (Sigma-Aldrich: V5255 clone VIM-13.2).
Biệt hóa tế bào gốc trung mô tủy xương người thành nguyên bào xương
Ở lần cấy chuyền thứ 2, tế bào được đem đi biệt hóa thành nguyên bào xương bằng cách loại bỏ môi trường cũ và thay bằng môi trường cảm ứng tạo nguyên bào xương gồm: IMDM, 15% FBS, 10-7M Dexamethasone, 10mM/ml b-Glycerol phosphate, 50ng/ml Ascorbic acid, 10ng/ml FGF9, 10″7M vitamin D2 và pen/strep (1, 15).
Tế bào được nuôi trong tủ ấm ở 370C, 5%CO2. Thay môi trường mới mỗi 3 ngày/ 1 lần.
Xác định tế bào gốc trung mô biệt hóa thành nguyên bào xương
Tế bào sau khoảng thời gian nuôi cấy từ 14 – 21 ngày, sẽ đánh giá khả năng biệt hóa thành nguyên bào xương bằng cách nhuộm hóa mô miễn dịch huỳnh quang với 2 marker Osterix (M15: SC-22538, Santa Cruz Biotechnology inc) và RUNX2 (C-19:SC 8566, Santa Cruz Biotechnology inc). Ngoài ra, thực hiện phản ứng RT-PCR để đánh giá sự biểu hiện của 2 marker Osteocalcin và Osteopontin đặc hiệu cho nguyên bào xương.
Nuôi cấy và biệt hóa tế bào gốc trung mô trên giá thể san hô (4, 5, 6, 7, 16)
Tế bào sau khi nuôi trong chai nuôi sẽ được tách khỏi chai nuôi bằng dung dịch Trypsin- EDTA (Gibco). Dịch tế bào sau khi tách cho vào tube sạch, vô trùng. Bổ sung 5ml môi trường nuôi và cho mẫu san hô vào tube. Huyền phù và quay ly tâm ở tốc độ 1000 vòng/ 1 phút. Sau đó, tiếp tục huyền phù dịch tế bào và quay li tâm 1000 vòng/ 1 phút cho đến lần thứ 5.
Lấy mẫu san hô ra và cho vào chai nuôi, bổ sung môi trường nuôi (IMDM, 15% FBS, Pen/Strep) sao cho vừa đủ ngập mảnh san hô. Ủ trong tủ nuôi ở 370C, 5%CO2.
Sau một ngày nuôi cấy, môi trường được thay bằng môi trường cảm ứng tạo nguyên bào xương như trên. Thay môi trường mới mỗi 3 ngày/ 1 lần.