Nuôi giữ bảo tồn nguồn gen ký sinh trùng đơn bào ký sinh và gây bệnh

Vấn đề nuôi cấy đơn bào trong phòng thí nghiệm đã được chú ý từ lâu. Đến năm 1918 hai tác giả là Boeck và Drbohlav đã tìm ra môi trường để nuôi cấy amíp gây bệnh Entamoeba histolytica.
Ở Việt Nam trong những năm trước đây cũng đã có một số cơ sở trong đó có Bộ môn Ký sinh trùng Trường Đại học Y Hà Nội đã nghiên cứu nuôi cấy E.histolytica bằng môi trường Pavlova và thu được những kết quả nhất định. Tuy nhiên, việc nuôi cấy rất khó khăn do thể hoạt động của amíp rất dễ chết nên vẫn chưa nuôi cấy được dài ngày [1].
Để đáp ứng những yêu cầu cần thiết phải nuôi giữ dài ngày các chủng đơn bào ký sinh, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nuôi giữ bảo tồn nguồn gen ký sinh trùng đơn bào ký sinh và gây bệnh” nhằm các mục tiêu sau:
1.    Xây dựng qui trình nuôi cấy đơn bào thường qui áp dụng trong Labo.
2.    Nuôi giữ bảo tồn một số loại đơn bào kỷ sinh và gây bệnh ở người.
2.    ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.    Đối tượng
–    E.histolytica phân lập từ phân bệnh nhân có hội chứng lỵ. Chúng tôi đã phân lập được 35 mẫu bệnh phẩm có E.histolytica, ký hiệu từ H1 đến H15. Trong đó mẫu H2 đã được làm phản ứng PCR với gen mồi là E.histolytica và cho kết quả dương tính.
–    E.gingivalis: 18 mẫu bệnh phẩm có E.gingivalis được phân lập từ bựa răng của những bệnh nhân viêm quanh răng, ký hiệu từ G1 đến G18.
–    Acanthamoeba: 7 mẫu bệnh phẩm có Acanthamoeba phân lập từ mảnh giác mạc của bệnh nhân bị viêm loét giác mạc, ký hiệu từ M1 đến M7 (Viện mắt TƯ gửi đến).
–     Trichomonas vaginalis: 48 mẫu bệnh phẩm có T.vaginalis phân lập từ dịch nhày âm đạo của bệnh nhân viêm âm hộ – âm đạo, ký hiệu từ V1 đến V48.
2.2.    Vật liệu nghiên cứu
2.2.1.    Môi trường nuôi cấy Pavlova
Là loại môi trường lỏng, rẻ tiền, dễ pha chế đã đựợc sử dụng từ lâu gồm:
–    NaCl: 4,25g; Na2HPO4: 0,30g; HPO4: 0,23g; Nước cất: 500ml.
2.2.2.    Huyết thanh động vật cho môi trường nuôi cấy: huyết thanh ngựa được cho vào môi trường ngay trước khi cấy với các tỷ lệ 5%, 10% và 15%.
2.2.3.     Tinh bột gạo: tinh bột gạo được sấy bảo quản vô trùng và chỉ cho vào môi trường một lượng nhỏ (3-10mg) trước khi tiến hành cấy.
2.2.4.    Dung dịch nhuộm để định loại: hematoxylin, hematoxylin-eosin.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.    Kỹ thuật pha môi trường Pavlova: pha theo công thức, điều chỉnh pH=6- 6,5. Chia vào các ống nuôi cấy, mỗi ống 5ml, hấp tiệt trùng. Để nguội và bảo quản trong tủ lạnh.
2.3.2.    Kỹ thuật nuôi cấy [3], [6]
–    Cấy bệnh phẩm: Sau khi lấy bệnh phẩm, xét nghiệm thấy có đơn bào phải tiến hành cấy ngay vào môi trường (đã được làm ấm) và để ở tủ ấm 370C.
–    Cấy truyền trên môi trường: Cấy truyền liên tiếp từ môi trường đang cấy sang môi trường mới.
–    Đánh giá kết quả nuôi cấy tốt: đơn bào sống, hoạt động, mật độ cao.
2.3.3.    Kỹ thuật xác định mật độ đơn bào trong môi trường nuôi cấy: Đếm số lượng đơn bào có trong 0,05ml môi trường nuôi cấy.
2.3.4.     Kỹ thuật nhuộm đơn bào: Nhuộm Hematoxylin feric của Heidenhain và nhuộm cải tiến Hematoxylin-Eosin.
2.3.5.    Phản    ứng    PCR để định    loại    đơn    bào:    tiến    hành    tại    Labo Trung tâm,
Trường ĐHY HN.
2.3.6.    Xử lý số liệu: Theo phương pháp thống kê y sinh học.