PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH ALPHA THALASSEMIA (05 ĐỘT BIẾN)

PCR DETECTION OF ALPHA THALASEMIA GENE MUTATION (5 MUTATIONS)

 

NGUYÊN LÝ

Phản ứng tổng hợp chuỗi (PCR) là phản ứng cho phép nhân bản chính xác một trình tự ADN quan tâm lên hàng triệu lần. Sử dụng phương pháp PCR thông thường với một cặp mồi đặc trưng chỉ phát hiện được một đột biến. Để phát hiện nhiều hơn một đột biến sẽ phải làm nhiều xét nghiệm PCR. Có rất nhiều loại đột biến gây bệnh anpha Thalassemia. Trong trường hợp này sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR là giải pháp tối ưu. Đây là phương pháp sử dụng nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng PCR. Như vậy chỉ cần một phản ứng Multiplex PCR chúng ta đã có thể phát hiện được nhiều đột biến cùng một lúc.

CHỈ ĐỊNH

Sử dụng cho tất cả người bệnh có chẩn đoán Alpha – Thalassemia.

CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo.

Phương tiện – Hóa chất

Phương tiện

Máy PCR;

Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp ảnh;

Buồng vô trùng (biology cabinet);

Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);

Máy vortex;

Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;

Đầu côn có màng lọc;

Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;

Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;

Tủ lạnh 4 – 8⁰C, tủ âm sâu – 20⁰C;

Găng tay.

Hóa chất

Kit tách ADN thương mại hoặc các hóa chất cần thiết cho tách chiết thủ công ADN (proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối).

Hóa chất chạy PCR gồm: Đệm, MgCl₂, dNTPs, enzym kéo dài chuỗi, nước khử ion vô trùng.

Các mồi đặc hiệu gồm 12 mồi để xác định đồng thời 5 đột biến mất đoạn; đồng thời cho biết tính đồng hợp, dị hợp tử đột biến và 1 cặp mồi sử dụng làm chứng nội kiểm (Internal control). Theo bảng sau:

Mồi	Trình tự
SEA CF	5’ – CTC TGT GTT CTC CAG TAT TGG AGG GAA GGA G – 3’
SEA NR	5’ – TGA AGA GCC TGC AGG ACC AGG TCA GTG ACC G – 3’
SEA MR	5’ – ATA TAT GGG TCT GGA AGT GTA TCC CTC CCA – 3’
FIL MF	5’ – AAG AGA ATA AAC CAC CCA ATT TTT AAA TGG GCA – 3’
FIL MR	5’ – GAG ATA ATA ACC TTT ATC TGC CAC ATG TAG CAA – 3’
THAI MF	5’ – CAC GAG TAA AAC ATC AAG TAC ACT CCA GCC – 3’
THAI MR	5’ – TGG ATC TGC ACC TCT TGG GTA GGT TCT CTA CC – 3’
α2/3.7 F	5’ – CCC CTC GCC AAG TCC ACC C – 3’
3.7/20.5R	5’ – AAA GCA CTC TGA GGG TCC AGC G – 3’
α2 R	5’ – AGA CCA GGA AGG GCC GGT G – 3’
4.2 R	5’ – CCC GTT GGA TCT TCT CAT TTC CC – 3’
4.2 F	5’ – GGT TTA CCC ATG TGG TGC CTC – 3’

Thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN.

Thuốc nhuộm ethidium bromide.

Bệnh phẩm

ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA.

Phiếu xét nghiệm

Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu xét nghiệm.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Lấy bệnh phẩm

ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA.

Tiến hành kỹ thuật

Tách chiết ADN

Xem bài “ Tách chiết ADN từ máu ngoại vi”

Thực hiện phản ứng Multiplex PCR phát hiện 5 đột biến bệnh alpha thalassaemia.

STT	Sinh phẩm	Thành phần (µl)/1 pứ
1	H2O	5,5
2	2X GoTaq Green MM	12,5
3	DMSO	1,0
4	Hỗn hợp mồi	5,0
5	DNA	1,0
	Tổng thể tích	25,0

Ly tâm nhẹ để các thành phần lắng xuống đáy ống hoàn toàn

Đặt vào máy PCR

Chọn chương trình

Bấm start để máy chạy

Điện di sản phẩm PCR

Chuẩn bị gel agarose

Cân 1 g agarose cho vào bình thủy tinh chịu nhiệt.

Thêm 100 ml đệm điện di (TAE 1X /TBE 1X…) vào bình, lắc đều.

Đun mỗi lần 1 phút trong lò vi sóng đến khi agarose tan hoàn toàn.

Để ấm đến 60⁰ rồi đổ vào khay đã cắm lược.

Để nhiệt độ phòng 30 phút để thạch đông rồi mới rút lược ra.

Điện di

Lấy 5 µl sản phẩm PCR + 1 µl đệm tra mẫu + 4 µl dH₂0

Trộn đều và nhỏ vào các giếng theo thứ tự

Nhỏ 3 µl marker ADN vào giếng kế tiếp

Đặt bản gel vào máy điện di

Đổ đệm điện di ngập bản gel và chạy ở 100 V trong 20 phút

Nhuộm bản gel với dung dịch ethidium bromide trong 5 phút

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Kết quả dương tính nếu nhìn thấy vạch sáng dưới đèn UV, sản phẩm có kích thước phù hợp theo lý thuyết.

VII . NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

SAI SÓT	XỬ TRÍ
Lấy mẫu không đủ hoặc sai chất chống đông.	Thực hiện theo đúng hướng dẫn qui cách lấy mẫu.
Thao tác pipet không chính xác.	Sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định.
Tín hiệu phản ứng không rõ ràng.	Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất Thực hiện đúng, đủ các bước trong quy trình xét nghiệm.

 

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Chong et al., Single – tube multiplex – PCR screen for common deletional determinants of a – thalassemia. Blood 2000;95: 360–362.

Old JM DNA – based diagnosis of the hemoglobin disorders. In: Steinberg MH,

Forget PG, Higgs DR, Nagel RL (eds) Disorders of Hemoglobin: Genetics, Pathophysiology, and Clinical Management. Cambridge University Press, Cambridge, UK(2001). pp 941 – 57.