PHÁ VỠ ESCHERISCHIA COLI TÁI TỔ HỢP BẰNG LYSOZYM ĐÊ PHÂN TÍCH CÁC ENZYM Được BIỀU HIỆN

Việc thu thập protein tái tổ hợp sau khi biến nạp vào Escherichia coli, nhất là những protein có hoạt tính enzym, đòi hỏi một phương pháp phá vỡ tế bào hợp lý để hoạt tính enzym được bảo toàn. Nghiên cứu nhằm sử dụng lysozym để phá vỡ Escherichia coli. Phương pháp nghiên cứu: chủng tế bào ER 3081 được biến nạp với pSAPV6 tái tổ hợp chứa gen enzym hạn chế của chủng Rothia dendocariosa ATCC 17931. Lysozym được dùng để phá vỡ tế bào ở các điều kiện thí nghiệm khác nhau và đồng thời hoạt tính enzym hạn chế được kiểm tra. Kết quả cho thấy phương pháp sử dụng lysozym để phá vỡ vi khuẩn cho phép thu thập enzym hạn ché tái tổ hợp giữ hoạt tính cao.

Trong lịch sử, Escherichia coli thường được sử dụng khi nghiên cứu các thành phần của sinh tổng hợp tế bào. Gần đây, với sự phát triển ngành sinh học phân tử, vi khuẩn này còn được dùng làm tế bào chủ cho các plasmit tái tổ hợp trong phương pháp tách dòng gen. Phương pháp này rất cần thiết cho việc sản xuất các loại protein ứng dụng trong nghiên cứu và nhiều lĩnh vực của đời sống xã hội [2], Việc nghiên cứu các protein trong nguyên sinh chất của Escherichia coli đòi hỏi trải qua giai đoạn phá vỡ tế bào vi khuẩn. Có rất nhiều phương pháp vật lý đã được dùng như nghiền nát, siêu âm hoặc nhiệt độ cao để làm vỡ cả màng và vách tế bào. Có phương pháp sử dụng chất hóa học như dùng hóa chất kiềm. Vấn đề đặt ra là lựa chọn một phương pháp phù hợp nhằm bảo vệ được hoạt tính cao của những protein dễ bị thoái hóa. Điều đó có nghĩa là phương pháp này chỉ sử dụng với nhiệt độ không quá 40°c hoặc một số hóa chất thích hợp. Những phương pháp thường được dùng như siêu âm, nghiền nát, áp lực cao đã được nhiều tác giả nghiên cứu so sánh vái nhau [1]. Việc dùng máy móc thường tạo ra hiệu lực rất cao để vỡ màng tế bào nhưng cũng ảnh hưởng không ít đến sự nguyên vẹn của các protein được giải phóng. Mặt khác, các vách tế bào vi khuẩn chứa một lớp pepti- doglycan và lysozym là một enzym có chức năng phân hủy đặc hiệu peptidoglycan, do vậy nó có vai trò làm phá vã các vi khuẩn. Tuy nhiên, peptidoglycan là thành phần chính của vách tế bào ở vi khuẩn Gram + trong khi ở vi khuẩn Gram – trong đó có Escherichia coli, lớp peptidoglycan mỏng và còn bị bao phủ bằng một lớp màng bên ngoài [3]. Sử dụng phương pháp enzym để phá vỡ vi khuẩn là tốt nhất để giữ nguyên vẹn các protein trong nguyên sinh chất, thêm nữa không đòi hỏi máy móc.

Đã có một quy trình sử dụng lyzozym ở nhiệt độ cao 100°c để phá vi khuẩn Escherichia coli trong quá trình tách chiết DNA [4]. Tuy nhiên, quy trình này không áp dụng được cho việc nghiên cứu protein vì nhiệt độ cao làm thoái hóa và mất hoạt tính protein. Vì lý do đó, chúng tôi nghiên cứu sử dụng lysozym để phá vỡ vi khuẩn Escherichia coli ở nhiệt độ < 40°c nhằm bảo vệ được hoạt tính protein. Quy trình này áp dụng cho việc phân tích các enzym tái tổ hợp được biểu hiện trong nguyên sinh chất.