Phân lập, nuôi cấy và bước đau nghiên cứu khả năng biệt hóa tế bào gốc tủy xương người

Mesenchymal stem cell (MSC) – tế bào gốc trưởng thành cố khả năng biệt hóa tạo nhiều dòng tế bào cố nguồn gốc khác nhau. Mục tiêu: (1) Áp dụng qui trình phân lập, nuôi cây dài ngày tế bào gốc trung mô nguồn gốc tủy xương người. (2) Bước đầu nghiên cứu khả năng đa biệt hóa của tế bào gốc trung mô tủy xương người. Đối tượng và phương pháp: Tủy xương của bệnh nhân không cố bệnh lí về huyết học và tủy xương (n=5). Tiến hành phân lập và nuôi cây dài ngày MSC từ tủy xương người. Xác định các marker bề mặt của tế bào gốc máu (CD34) và tế bào limpho (CD45). Biệt hóa MSC theo hướng cơ tim. Xác định biểu hiện một sốgen trước và sau biệt hóa bằng kĩ thuật RT-PCR. Kết quả: Phân lập và nuôi cây thành công 5 mẫu MSC từ tủy xương người. Hầu hết các tế bào nuôi cây âm tính với CD34 và CD45 ở các giai đoạn nuôi cây. Kết quả RT-PCR cho thây các tế bào trước biệt hóa cố biểu hiện gen PIII- Tubulin, Mef 2A, Mef 2C, Mef 2D, GATA-4, sau biệt hóa cố biểu hiện tăng cường một số gen đặc trưng cho tế bào cơ xương (Mef 2A, Mef 2C, Mef 2D) và tế bào cơ tim GATA-4. Kết luận: Áp dụng thành công qui trình phân lập, nuôi cây lâu dài MSC từ tủy xương người. Bước đầu biệt hóa thành công MSC theo hướng cơ tim dựa vào mức độ biểu hiện gen đặc trưng cho tế bào cơ xương và tế bào cơ tim.
1.    ĐẠT VẤN ĐỂ
Những năm gần đây, tế bào bào gốc trung mô – MSC (Mesenchymal Stem Cell) đã và đang thu hút được sự quan tâm của giới khoa học, bởi chúng có khả năng tự làm mới, tăng sinh, biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau. Tủy xương được kể đến như là một nguồn cung cấp tế bào gốc trưởng thành đầu tiên, tuy nhiên ngày nay người ta đã có thể tách được tế bào gốc từ các tổ chức: mỡ, cơ, gan, da v.v [11, 6, 7, 3]. In vitro, dưới các điều kiện nuôi cấy đặc biệt, MSC có khả năng biệt hóa, thành các tế bào thuộc tổ chức trung bì (tế bào mỡ, tế bào xương, tế bào sụn), tế bào thuộc tổ chức ngoại bì (tế bào thần kinh, tế bào biểu mô), tế bào thuộc tổ chức nội bì (tế bào gan, tế bào đảo tụy)[4]. Nhờ khả năng đa biệt hóa, MSC rất được kỳ vọng trong việc ứng dụng liệu pháp gen, nhắm tới các gen bị khiếm khuyết, cung cấp các protein cho điều trị và các liệu pháp cấy ghép khác. Hiện nay, các nghiên cứu về tế bào gốc nói chung, MSC nói riêng đã và đang bắt đầu được tiến hành tại Việt Nam. Đề tài này được thực hiện với mục tiêu:
–    Áp dụng qui trình phân lập, nuôi cấy dài ngày tế bào gốc trung mô nguồn gốc tủy xương người.
–    Bước đầu nghiên cứu khả năng đa biệt hóa của tế bào gốc trung mô tủy xương người.
2.    PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1.    Đối tượng nghiên cứu
Tủy xương của bệnh nhân không có bệnh lí về huyết học và tủy xương, BV Quân đội 108 (n=5).
2.2.    Phương pháp nghiên cứu
2.2.1.     Phân lập, nuôi cấy MSC từ tủy xương người: Tủy xương với thể tích 1- 2 ml, được chống đông, bảo quản lạnh 40C, tiến hành tách MSC ngay trong ngày. ủ bằng dung dịch cocktail. Li tâm 1200 vòng/ phút x 30 phút, tạo gradient tỉ trọng bằng dung dịch Histopaque 1017 và môi trường nuôi cấy, tỉ lệ 1:1. Thu hoạch lớp tế bào “vòng nhẫn”, rửa lại bằng môi trường, nuôi cấy trong flask T- 25 với mật độ 105 tế bào/ml. Không thay môi trường lần đầu trong 7- 9 ngày. Sau đó thay mới môi trường 2 lần/ tuần . Môi trường nuôi cấy (NM): Dullbecco’s modifies Eagle’s medium – low glucose (DMEM-LG), 10% fetal bovine serum (FBS). Nuôi cấy trong tủ ấm 370C, 5% CO2. Khi tế bào phát triển 60% – 80%, cấy chuyển bằng cách sử dụng trypsin – EDTA 0,25%. Mật độ tế bào nuôi cấy 103 tế bào/ml. Kí hiệu giai đoạn cấy chuyển lần lượt là P0, P1, P2.v.v…
2.2.2.    Xác đinh hình thái và sự phát triển tế bào: Quan sát trực tiếp trên kính hiển vi đối pha. Nhuộm nhân và bào tương bằng Hematoxylin eosin (HE).
2.2.3.    Xác đinh marker của dòng tế bào gốc máu (CD34) và dòng tế bào limpho (CD45) qua các giai đoạn nuôi cấy bằng phương pháp nhuộm hóa tế” bào miễn dich (ICC), hóa mô miễn dich (IHC): Cố định mẫu: Tại các giai đoạn cấy chuyển, thu hoạch mẫu tế bào bám trên coverslip (nhuộm ICC) hoặc tách tế bào bằng trypsin – EDTA 0,25%, li tâm lấy cặn (nhuộm IHC). Cố định bằng paraformaldehyd 4%/PBS. Đúc paraphin cặn tế bào. Nhuộm hóa miễn dịch: Độ dày mẫu đúc paraphin là 5 ụm. Loại paraphin. Bộc lộ kháng nguyên bằng đêm pH= 6,0 và nhiệt độ. Rửa bằng PBS. Khử H2O2 nội sinh bằng H2O2 3%. Rửa PBS x 3 lần. ủ kháng thể thứ nhất (pha loãng 1/1000) x 60 phút, nhiệt độ phòng. Rửa PBS 5 phút/lần x 3 lần. ủ kháng thể thứ hai trong 60 phút, trong buồng giữ ẩm. Rửa lại bằng đệm. ủ Streptavidin- HRP x 60 phút. Rửa PBS. Nhuộm 3,3′- Diaminobenzidine (DAB). Nhuộm Hematoxylin nhân và bào tương. Đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học. Kết quả dương tính: Tế bào bắt mầu nâu vàng ở chu vi tế bào hoặc ở diện tích bào tương.
2.2.4.    Xác đinh khả năng đa biệt hóa của MSC bằng kĩ thuật RT-PCR và Nested-PCR:
+ Tách chiết RNA tổng số từ tế bào nuôi cấy + Tổng hợp cDNA
+ Quy trình của phản ứng PCR: Tổng thể tích phản ứng là 20ụl, bao gồm: 3 ụ! cDNA, 2ụl 10x Ex Taq Buffer, 2 ụl 2.5mM dNTPs, 10 pmol mồi xuôi và ngược, 1 unit Ex Taq Polymerase (Takara Bio Inc.Kyoto, Japan). Chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau: 950 C x 10 phút{950 C trong 60 giây, 650C trong 30 giây, 720C trong 60 giây} x 40 chu kỳ, 720C x 7 phút. Điện di trên gel agarose 1,5%.
2.2.5.    Biệt hóa MSC theo hướng cơ tim: MSC được nhân nuôi liên tục trong NM, sau giai đoạn cấy chuyển thứ 3, NM được thay thế bằng môi trường biệt hóa theo hướng cơ tim. Thu hoạch, đánh giá tại các thời điểm 7, 14, 21 ngày.
Môi trường biệt hóa theo hướng cơ tim (SM): 60% DMEM-LG/28% MCDB-201 (Sigma),1.0 mg/ml bovine insulin, 0.55 mg/ml human transferrin, 0.5 ụg/ml sodium selenite, 50 mg/ml bovine serum albumin, 0.47 ụg/ml linoleic acid, 10 -4 M ascorbate phosphate, 10 -9 M dexamethasone (Sigma), 100 U/ml penicillin G, 100 ụg/ml streptomycin sulfate (GIBCO), and 10% fetal bovine serum.
2.3.    Hóa chất, thiết bi
2.3.1.    Trang thiết bi: Tủ duy trì nhiệt độ và nồng độ CO2: HEPA-NUAIRE;
Cabin vô khuẩn: Biological Safety Cabinets Class II- NUAIRE; Máy li tâm: Kubota 5922 Japan; Gene AmpPCR System 9700; Máy chụp gel: Dolphin- Chemi – Wealtec; Kính hiển vi quang học đối pha; Tủ lạnh – 20ỐC, – 800C.
2.3.2.    Hoá chất
+ Hóa chất dùng để phân lập, nuôi cấy và biệt hóa MSC từ tủy xương:
Human mesenchymal cell enrichment cocktail (RosetteSep);- Histopaque 1077 (Sigma-Aldrich);
–    DMEM-LG (Invitrogen);- FBS – fetal bonvine serum (Invitrogen);- Gentamycin-Streptomycin (Invitrogen);- Trypsin-EDTA 0,25% (Invitrogen);- PBS – Phosphat buffer saline (Invitrogen);
–    MCD-201;- Bovine insulin;- Human transferin;- Sodium selenite;- Bovine serum albumin;
–    Linoleic acid;- Ascorbat phosphat;- Dexamethason (Sigma).
+ Hóa chất của kĩ thuật hóa mô miễn dịch xác định marker bề mặt: Các kháng thể đơn dòng kháng: CD34; CD45 và các hóa chất theo kit (Dako)
+ Hóa chất của kĩ thuật RT-PCR, Nested-PCR: Isogen; isopropanol; Dung dịch DEPC; dNTP; first strand PCR buffer; DTT (ức chế protein); HPRI (ức chế Rnase); MMLV-RT (enzym tổng hợp); Ex Taq Buffer (Takara Bio Inc.Kyoto, Japan). Trình tự các cặp mồi:
pIII-Tubulin (5’-GAGCGGGATCAGCGTCTACTA-GTCGCAGTTTTCACACTCCT-3’, 264 bp); GFAP (5’-GAGTACCAGGACCTGCTCAA-TTCACCACGATGTTCCTCTT-3’, 203 bp);
GATA-4 (5’-TCAAATTGGGATTTTCCGGA – GCACGTAGACTGGCGAGGA- 3’, 347 bp);
Mef 2A (5 -TCCAATTGTGCTTGGCCGA- ACATACACACACACTCACACCCA-3’,247bp);
Mef 2C (5’-ACTTTCTGAAGGATGGGCAA – CAAGTGCTAAGCTTATCTCAGCA-3’ , 230 bp); Mef 2D (5’-TGAAGATCCCCCGGACCA – CTCGTCGGTGATTCGCTGGA- 3’, 253 bp); Nkx2.5/Csx (5’-AGCCCTGGCTACAGCTGCA- TGGGAGCCCCTTCTCCCCA- 3’, 262 bp).