Phân lập và sàng lọc niêm khuẩn sinh chất có hoạt tính sinh học tại Việt Nam
Luận án tiến sĩ dược học Phân lập và sàng lọc niêm khuẩn sinh chất có hoạt tính sinh học tại Việt Nam.Hiện nay, sự đề kháng kháng sinh và nhu cầu hóa trị liệu ung thư đã đặt ra những yêu cầu cấp thiết tiến hành các nghiên cứu khám phá nguồn tài nguyên thiên nhiên, hướng tới tìm ra và xác định các hợp chất sinh học mới. Trong đó, vi sinh vật từ tự nhiên có ý nghĩa quan trọng đối với ngành Dược trong việc tạo ra các hợp chất sinh học có khả năng phòng ngừa và điều trị bệnh như nhóm thuốc kháng sinh kháng khuẩn, kháng nấm, các chất chống oxy hóa, chất kháng tế bào ung thư… Phần lớn các kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn (Actinobacteria) và niêm khuẩn (Myxobacteria). Được báo cáo lần đầu tiên vào những năm 1892, niêm khuẩn là vi sinh vật đơn bào thuộc nhóm ỗ-proteobacteria 1, hiện diện trong các hệ sinh thái tự nhiên, tuy nhiên, hầu hết các loài được phân lập từ đất nên thường được xem là vi sinh vật điển hình và chiếm ưu thế trong đất 1. Chính sự cạnh tranh trong môi trường tự nhiên đã thúc đẩy việc sản xuất các hợp chất sinh học quan trọng từ niêm khuẩn.
Nhiều công bố cho thấy niêm khuẩn có khả năng sản xuất các hợp chất thứ cấp với cấu trúc và hoạt tính sinh học đa dạng như kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật và độc tế bào 2. Chất kháng nấm ambruticin là một trong những hợp chất đầu tiên được phân lập từ niêm khuẩn (1977) 3. Kế thừa nghiên cứu này, những hợp chất sau đó được phân lập, như chống oxy hóa (soraphinol C 4, DK-xanthen 5), kháng khuẩn (coralmycin, cystobactermid, myxovalargin), kháng nấm (ambruticin, ajudazol, chevosazol), kháng virus (aetheramid, chondramid, stigmatellin), gây độc tế bào (epothilon, rhizopodin, tubulysin) 6, điều hòa miễn dịch (argyrin) 7 và kháng ký sinh trùng (chlorotonil) 8. Trong đó, một số hợp chất đã được sử dụng trong ngành y dược như crocapeptin, crocagin, crocadepsin, eremophilen, cittilin, myxoprincomid, homospermidin, alkylpyron và salimabromid 6. Nổi bật nhất phải kể đến hoạt chất epothilon – chất chuyển hóa thứ cấp từ Sorangium cellulosum – với khả năng kháng ung thư mạnh và ít tác dụng phụ hơn so với taxol đã được chấp thuận sử dụng trong điều trị ung thư vú 9. Các khám phá nối tiếp nhau không ngừng khẳng định vai trò sinh học phong phú của niêm khuẩn trong đóng góp hơn 100 cấu trúc gốc và 600 dẫn xuất vào ngân hàng chất chuyển hóa từ vi sinh vật 10.
Đến đầu những năm 2000, do những khó khăn trong phân lập các chủng niêm khuẩn từ chất nền tự nhiên, chỉ khoảng 40 loài niêm khuẩn được mô tả, nhưng một lượng lớn chủng sản xuất các chất chuyển hóa khác nhau đã được phân lập. Reichenbach (2001) báo cáo nhóm nghiên cứu tại Trung tâm Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Đức đã phân lập và sàng lọc 6.000 chủng niêm khuẩn trong 20 năm, và phát hiện 4-8 cấu trúc mới mỗi năm. Nhìn chung, các cấu trúc này thường chỉ tìm thấy ở niêm khuẩn với cơ chế tác động mới mà không hiện diện ở nhóm vi sinh vật khác n.
Theo báo cáo tổng hợp các nghiên cứu về tính đa dạng trong phân bố niêm khuẩn trên toàn thế giới bởi Jingjing Wang và cộng sự (2021) cho thấy bản đồ nghiên cứu niêm khuẩn trải rộng khắp các châu lục và vùng biển 12. Tuy nhiên, Việt Nam chưa được định vị trên bản đồ nghiên cứu phân bố này. Sở hữu khu vực địa lý đa dạng và vùng khí hậu nhiệt đới đặc trưng, nước ta có hệ vi sinh vật tự nhiên phong phú. Từ đó, chúng tôi tin rằng khai thác nguồn niêm khuẩn trong môi trường đất có thể mở ra tiền đề cho các cấu trúc chất chuyển hóa tiềm năng định hướng sản xuất thuốc và hóa trị liệu hợp chất tự nhiên. Từ những lý do trên, luận án “Phân lập và sàng lọc niêm khuẩn sinh chất có hoạt tính sinh học tại Việt Nam” được thực hiện nhằm đạt được các mục tiêu sau:
1. Phân lập và định danh các chủng niêm khuẩn từ đất tại một số tỉnh, thành phố ở Việt Nam.
2. Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật, kháng ung thư từ dịch chiết các chủng niêm khuẩn.
3. Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất thứ cấp từ dịch chiết của môi trường lên men chủng có hoạt tính sinh học cao.
4. Tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy chủng có hoạt tính sinh học nhằm tăng hàm lượng hoạt chất.
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH VIỆT iv
DANH MỤC BẢNG ix
DANH MỤC HÌNH xi
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tổng quan chung về niêm khuẩn 3
1.2. Niêm khuẩn – nguồn sản xuất các chất có hoạt tính sinh học 11
1.3. Các phương pháp nghiên cứu niêm khuẩn 20
1.4. Các phương pháp chiết xuất hợp chất thứ cấp từ niêm khuẩn 27
1.5. Các phương pháp phân tích và xác định cấu trúc hợp chất thứ cấp 30
1.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 32
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36
2.1. Đối tượng nghiên cứu 36
2.2. Vật liệu 36
2.3. Phương pháp nghiên cứu 38
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 64
3.1. Phân lập và định danh niêm khuẩn 64
3.2. Sàng lọc hoạt tính sinh học 75
3.3. Chủng niêm khuẩn tiềm năng Myxococcus stipitatus GL41 85
Chương 4. BÀN LUẬN 113
4.1. Phân lập niêm khuẩn 113
4.2. Định danh niêm khuẩn 119
4.3. Hoạt tính sinh học của niêm khuẩn 124
4.4. Chủng tiềm năng Myxococcus stipitatus GL41 128
Điểm mới của đề tài 138
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 140
KẾT LUẬN 140
KIẾN NGHỊ 141
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN 142
TÀI LIỆU THAM KHẢO 143
PHỤ LỤC PL1-106
DANH MỤC BẢNG
•
Bảng 1.1. Các hợp chất có hoạt tính sinh học phân lập từ niêm khuẩn 16
Bảng 2.1. Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu 37
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 37
Bảng 2.3. Đặc điểm sinh hóa của một số chi niêm khuẩn thường gặp 44
Bảng 2.4. Thành phần PCR 46
Bảng 2.5. Chương trình pha động LC-MS 54
Bảng 2.6. Chương trình pha động sắc ký cột nhanh 55
Bảng 2.7. Chương trình pha động kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC 57
Bảng 2.8. Các thành phần được khảo sát trong ma trận Plackett-Burman 59
Bảng 2.9. Ma trận thiết kế thí nghiệm theo Plackett-Burman 60
Bảng 2.10. Chương trình pha động định lượng althiomycin bằng HPLC 63
Bảng 3.1. Kết quả định danh 43 niêm khuẩn dựa trên đặc điểm hình thái 69
Bảng 3.2. Định danh 43 chủng niêm khuẩn dựa vào trình tự 16S rDNA 72
Bảng 3.3. Hoạt tính kháng oxy hóa 43 niêm khuẩn 76
Bảng 3.4. MIC của cao chiết các chủng niêm khuẩn được xác định bằng phương pháp
vi pha loãng (pg/mL) 79
Bảng 3.5. Số lượng niêm khuẩn theo từng chi có hoạt tính kháng vi sinh vật 81
Bảng 3.6. Phần trăm ức chế dòng tế bào ung thư MDA-MB-231 của 43 cao chiết .83
Bảng 3.7. Số lượng cao chiết từ niêm khuẩn ức chế tế bào MDA-MB-231 84
Bảng 3.8. Giá trị IC50 (pg/mL) của 7 niêm khuẩn 85
Bảng 3.9. Hoạt tính kháng tế bào ung thư MDA-MB-231 của các cao phân đoạn ..90
Bảng 3.10. Công thức phân tử và hợp chất đề xuất dựa trên kết quả ESI-HR-MS ..90
Bảng 3.11. Phổ hấp thu UV-Vis của althiomycin 94
Bảng 3.12. Dữ liệu NMR của hợp chất C3 và chất tham chiếu 95
Bảng 3.13. Dữ liệu NMR của hợp chất C7 và chất tham chiếu 99
Bảng 3.14. Dữ liệu NMR của hợp chất C8 và chất tham chiếu 102
Bảng 3.15. Giá trị MIC (pg/mL) của các hợp chất phân lập 103
Bảng 3.16. Giá trị IC50 (pM) của các hợp chất trên các dòng tế bào 105
Bảng 3.17. Giá trị các yếu tố ảnh hưởng trong thiết kế Plackett-Burman 106
Bảng 3.18. Phân tích thống kê các yếu tố trong thiết kế Plackett-Burman 106
Bảng 3.19. Nồng độ 3 yếu tố phân tích theo mô hình Box-Behnken 108
Bảng 3.20. Tối ưu hoá giá trị các yếu tố ảnh hưởng bằng RSM 108
Bảng 3.21. Phân tích phương sai của mô hình Box-Behnken 109
Bảng 3.22. Đánh giá mô hình tối ưu thu althiomycin trên thực nghiệm 111
Bảng 4.1. So sánh kết quả phân lập niêm khuẩn giữa các nghiên cứu 116
Bảng 4.2. So sánh sự đa dạng và tỉ lệ (%) các chủng niêm khuẩn phân lập từ các nghiên cứu 122
DANH MỤC HÌNH
•
Hình 1.1. Phân loại niêm khuẩn 4
Hình 1.2. Khóm lan và tế bào sinh dưỡng của niêm khuẩn 5
Hình 1.3. Hình minh họa bào tử bên trong thể quả niêm khuẩn 6
Hình 1.4. Sự phối hợp hệ thống A và S trong di động ở Myxococcus xanthus 8
Hình 1.5. Hình minh họa chu kỳ đa bào của Myxococcus xanthus 9
Hình 1.6. M. xanthus ly giải vi khuẩn E. coli 11
Hình 1.7. Một số hợp chất phân lập từ niêm khuẩn 18
Hình 1.8. Tỉ lệ (%) các chi có khả năng sản xuất chất thứ cấp từ niêm khuẩn 19
Hình 1.9. Phân lập niêm khuẩn 20
Hình 1.10. Mô hình lý thuyết và thực tế phương pháp đáp ứng bề mặt 26
Hình 1.11. Hướng nghiên cứu niêm khuẩn trên thế giới 33
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 39
Hình 2.2. Các phương pháp phân lập niêm khuẩn 41
Hình 3.1. Phân bố khu vực lấy mẫu đất 64
Hình 3.2. Hiệu quả của các hợp chất kháng nấm trong phương pháp dùng phân thỏ
65
Hình 3.3. Thể quả quan sát từ giấy lọc bị phân hủy 65
Hình 3.4. Thể quả niêm khuẩn khi phân lập bằng 3 phương pháp 66
Hình 3.5. Tỉ lệ các chủng được phân lập từ 3 phương pháp 66
Hình 3.6. Hình thái khuẩn lạc một số chủng niêm khuẩn trên môi trường VY/2 67
Hình 3.7. Hình thái thể quả một số chủng niêm khuẩn 68
Hình 3.8. Hình thái tế bào sinh dưỡng và bào tử quan sát dưới kính hiển vi 1000X68
Hình 3.9. Chuyển động trượt và ly giải vi khuẩn 70
Hình 3.10. Kết quả điện di đoạn 16S rDNA chủng TH41 và VL25 trên gel agarose
72
Hình 3.11. Cây phát sinh loài 57 chủng niêm khuẩn 75
Hình 3.12. Nồng độ ức chế 50% gốc tự do 8 chủng niêm khuẩn có hoạt tính cao …79
Hình 3.13. Mức độ kháng của các cao chiết trên vi sinh vật thử nghiệm 82
Hình 3.14. Hình thái đại thểM. stipitatus GL41 86
Hình 3.15. Hình tháiM. stipitatus GL41 quan sát kính hiển vi quang học 1000X ..86
Hình 3.16. Kết quả thử nghiệm API ZYM chủng GL41 87
Hình 3.17. Quan hệ phát sinh loài giữa chủng GL41 và các loài, chi thuộc phụ bộ
Cystobacterineae 88
Hình 3.18. Nhân giống và lên men chủngM. stipitatus GL41 88
Hình 3.19. Sơ đồ chiết cao phân đoạn chủng GL41 89
Hình 3.20. Sơ đồ chiết xuất và phân lập cao EtOAc của dịch lên men chủng M.
stipitatus GL41 92
Hình 3.21. Phổ NMR của hợp chất C3 94
Hình 3.22. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất C3 96
Hình 3.23. Phổ NMR của hợp chất C7 98
Hình 3.24. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất C7
100
Hình 3.25. Phổ NMR của hợp chất C8 101
Hình 3.26. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất C8
103
Hình 3.27. Các yếu tố ảnh hưởng đến APA 111
Nguồn: https://luanvanyhoc.com