Phân tách và xác định các Glycoprotein của bệnh nhân chậm phát triển tâm thần do hội chứng fragile X

Hội chứng Fragile X hay còn gọi là hội chứng nhiễm sắc thể (NST) X dễ gẫy, là một trong những rối  loạn  di truyền  chủ  yếu  gây  chậm  phát  triển tâm thần (CPTTT). Tần suất mắc hội chứng Fragile X trong quần  thể  dân  cư vào  khoảng  1/2000 – 4000 đối  với  nam và  1/4000 – 8000 đối  với  nữ. Nguyên nhân của hội chứng Fragile X là do đột biến  gen FMR1 (Fragile X Mental Retardation 1) nằm trên nhiễm sắc thể X. Sản phẩm của gen FMR1 là FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein = FMRP). Sự vắng mặt của FMRP trong hội chứng Fragile X là một trong những nguyên nhân chính gây  CPTTT. FMRP có  chức  năng  chính là vận chuyển ARN từ nhân ra bào tương, điều hoà quá  trình dịch mã,  FMRP được  cho là  có vai trò chính trong việc điều hoà vận  chuyển mARN tại tế bào thần kinh [3, 4]. FMRP tham gia điều hoà các protein khác trong cơ thể, đặc biệt là các protein tham gia cấu tạo hệ thần kinh, vì vậy khi FMRP bị biến đổi thì kéo theo sự biến đổi của một loạt các protein khác trong cơ thể [5, 8, 10].

Những  nghiên  cứu  về  gen đột  biến  FMR1 đã được tiến hành rất nhiều, tuy nhiên thách thức chính đối  với  các  nhà  khoa học  hiện  nay là  sự biến đổi hậu phiên mã, hơn nữa những hiểu biết về  hệ  protein của  các  bệnh  nhân  CPTTT do hội chứng  Fragile X còn  hạn  chế.  Liệu  sự  vắng  mặt của FMRP gây ra những biến đổi gì đối với các protein khác trong hệ protein và liên quan đến bệnh lý.

Dựa trên sự phát triển của ngành khoa học proteomics tại  Việt  Nam – một  ngành  khoa học nghiên cứu về proteome (hệ protein), chúng tôi tiến hành nghiên cứu hệ protein của các bệnh nhân CPTTT do hội chứng Fragile X, với bước đi đầu  tiên  là  nghiên  cứu  hệ  glycoprotein  trong huyết  thanh  của  bệnh  nhân.  Nghiên  cứu  này nhằm mục tiêu:

Xác định các biến đổi glycoprotein trong huyết thanh của các bệnh nhân CPTTT do hội chứng Fragile X.

I. ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG   PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng nghiên cứu

5 mẫu  huyết  thanh của  5 bệnh  nhân  nam bị CPTTT do hội  chứng  Fragile X được  chẩn  đoán trên lâm sàng và bằng di truyền tế bào có kết quả fragile X (NST X gẫy) dương tính.

5 mẫu huyết thanh của 5 người nam bình thường được sử dụng làm mẫu đối chứng. Người bình thường  không  phát  hiện  mắc  các  bệnh  cấp tính, mạn tính hay các bệnh lý di truyền.

Mẫu bệnh và mẫu đối chứng được lựa chọn bằng xét nghiệm di truyền tế bào tìm fragile X và tương ứng về tuổi, giới, chủng tộc.

2. Phương pháp nghiên cứu

Thu thập mẫu: Lấy máu tĩnh mạch ngoại vi không chống đông, ly tâm và thu 1 – 2 ml huyết thanh.

Sử dụng các kỹ thuật proteomics để phân tích hệ glycoprotein trong huyết thanh

Thu nhận glycoprotein qua cột sắc kí ái lực  với  ConA: 300 µl huyết  thanh  (tương đương khoảng  20 mg protein)  được  hòa  trong đệm  cân bằng lectin conA (tỷ lệ 1:10) và được đưa lên cột sắc kí với tốc độ dòng chảy là 0,1ml/phút. ConA kết hợp với sepharose ứng dụng để tinh sạch các loại   glycoprotein,  polysaccarid,   glycolipid,  các liên kết kháng thể, IgM, các glycoprotein ở bề mặt tế bào. Các glycoprotein bám trên cột sắc kí ConA được thôi ra bằng 8 ml dung dịch methyl –  – D – glucopyranosid 0,5 mM.

Điện di protein một chiều: Kiểm tra kết quả  protein thu được  bằng  kỹ  thuật  điện  di biến tính trên gel polyacrylamid (SDS – PAGE).

Điện  di protein hai chiều:  phân  tích thành  phần  và  mức  độ  biểu  hiện  của  protein. Điện di 2 chiều được thực hiện trên máy điện di đẳng điện PROTEAN IEF với ReadyStrip IPG strip, 7 cm, pH 4 – 7 của Bio – Rad (Bio – Rad, Hercules, CA, USA) sử  dụng  các  quy trình  theo hướng  dẫn của  nhà xản  xuất.  169 µg  glycoprotein được  hòa với  125 µl đệm  ReadyPrep Rehydration (ure 8M, 2%  CHAPS, DTT 50mM, 0,2% (w/v) Bio –  Lyte 3/10 ampholyte và Bromophenol Blue). Bước khử nước  (rehydrate hóa)  được  thực  hiện  trên  Ready Strip IPG strip trong 12 giờ, 45V. Chiều điện di 1, các glycoprotein được phân tách theo điểm đẳng điện (pI) trên hệ PROTEAN IEF. Sau đó các strip được khử bằng đệm cân bằng 1 (Ure 6M, SDS 2%, Tris – HCl pH 8,8 0,375M, glycerol 20% và DTT 2% (w/v))  và  alkyl hóa  bằng  đệm  cân  bằng  2 (Ure  6M, SDS 2%, Tris – HCl pH 8,8  0,375M, glycerol 20% và IAA 40 mg/ml). Chiều điện di 2, phân  tách  theo khối  lượng  phân  tử  bằng  điện  di SDS – PAGE 12,6% thực hiện ở điều kiện điện thế 120V trong 2 giờ.

Phân tích định lượng mức độ biểu hiện protein bằng công cụ tin sinh học: Gel điện di 2 chiều được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R250, sau đó quét bằng máy Molecular Imager FX và phân tích hình ảnh gel với sự hỗ trợ của phần mềm  PD Quest v7.1 (Bio – Rad,  Hercules,  CA, USA). Các điểm protein được so sánh vị trí tương đồng và định lượng mức độ biểu hiện trên ảnh 3 chiều giữa mẫu người thường và mẫu người bệnh. Những  điểm  có  sự  khác  biệt  đáng  kể  được  lựa chọn   và   cắt   tự   động   bằng   máy   Spot  Cutter (Bio – Rad, Hercules, CA, USA) để phân tích khối phổ.

Phân  tích  hỗn  hợp  protein  bằng  kỹ thuật  sắc  kí lỏng  2 chiều  kết  nối  khối  phổ  liên tục   (NanoLC  –  ESI  –   MS/MS)  và   nhận   dạng glycoprotein

Các điểm protein được cắt và thủy phân bằng trypsin. Hỗn  hợp  peptid sau khi thủy  phân  được phân tích trên hệ thống sắc kí nano LC (Packing, Dionex, Netherland). Peptid được loại muối và cô đặc trên cột TRAP C18 (PepMap100, LC Packing, Dionex, Netherland) và phân tách trên cột sắc kí ngược pha C18 (GraceVydac, Hesperia, CA, USA). Mẫu được đưa lên cột với tốc độ dòng 0,2 µl/phút bằng FA 0,1% và thôi ra khỏi cột C18 bằng gradient từ 0 đến 100% đệm B trong 90 phút. Quá trình thực hiện khối phổ liên tiếp được tiến hành trên máy QSTARR XL.

Ghi phổ nanoLC – ESI – MS/MS và phân  tích dữ liệu phổ bằng phần mềm Mascot v1.8. Ngưỡng độ tin cậy được đặt mặc định là 99.5%. Các protein có tổng điểm số trên 30. Các protein được nhận dạng và phân tích dựa trên cơ sở dữ liệu protein của  Homo sapiens của  toàn  bộ  cơ sở  dữ liệu NCBInr [1, 2, 9].