Phân tích đa hình A4889G của gen CYP1A1bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên bệnh nhân ung thư
Luận văn Phân tích đa hình A4889G của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên bệnh nhân ung thư .Hiện nay, trên thế giới, ung thư đã vượt qua cả bệnh tim mạch để trở thành nguyên nhân gây tử vong hàng đầu. Theo thống kê của cơ quan quốc tế nghiên cứu về ung thư (IARC), trong năm 2012 trên toàn thế giới có 14,1 triệu trường hợp ung thư mới, 8,2 triệu ca tử vong do ung thư.
Ung thư gan là một vấn đề lớn của các khu vực kém phát triển. Trong 782000 trường hợp ung thư gan mới ước tính xảy ra trên toàn thế giới vào năm 2012 thì các khu vực này chiếm 83% (riêng Trung Quốc chiếm 50%). Ung thư gan là loại ung thư phổ biến thứ 5 ở nam giới và thứ 9 ở nữ giới. Đông Á và Đông Nam Á là các khu vực có tỷ lệ mắc ung thư gan cao ở nam giới; trong khi đó, Đông Á và Tây Phi có tỷ lệ mắc cao nhất ở nữ giới. Ung thư gan là nguyên nhân tử vong do ung thư thứ 2 trên toàn thế giới, ước tính là gần 746000 trường hợp tử vong trong năm 2012 [18]. Sự phân bố của ung thư gan có sự chênh lệch giữa các vùng trên thế giới là do có sự khác nhau về các yếu tố nguy cơ và mức độ ảnh hưởng của chúng. Nhiễm virus viêm gan C hoặc viêm gan B là nguyên nhân chính của ung thư gan trên thế giới, chiếm 80% các trường hợp ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) [11]. Xơ gan, uống nhiều rượu, hút thuốc lá, ăn thức ăn nhiễm aflatoxin,… cũng là những yếu tố nguy cơ quan trọng dẫn đến ung thư gan.
Nguyên nhân gây ung thư có thể là do sự biến đổi trong vật chất di truyền của các gen sinh ung thư hay gen ức chế sinh ung thư, dẫn đến sự sai khác trong tiến trình tăng sinh bình thường của các tế bào. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh tính đa hình thái của các gen mã hóa cho các enzym nằm ở gan, chuyển hóa chất sinh ung thư có mối liên quan chặt chẽ với hoạt động của các enzym này. Một số điểm đa hình có thể liên quan đến khả năng mẫn cảm với bệnh, trong đó có cả ung thư gan [19].
CYP1A1 là một gen nằm ở vị trí q24.1 của NST số 15, mã hóa cho enzym CYP1A1-một enzym thuộc gia đình Cytochrome P450. CYP1A1 là một enzym chuyển hóa của con người, nó tham gia vào quá trình chuyển hóa của chất nội sinh và các loại thuốc, cũng như tham gia vào kích hoạt một số chất độc và chất thải gây ô nhiễm môi trường. Chuyển hóa của các chất gây ô nhiễm qua trung gian CYP1A1 có thể dẫn đến các chất chuyển hóa phản ứng hình thành các DNA adduct góp phần gây đột biến và cuối cùng hình thành khối u [21].
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy gen CYP1A1 có một số đa hình, trong đó đa hình m2 là một trong những đa hình được nghiên cứu nhiều nhất. Đa hình này là sự thay thế A thành G tại cặp nucleotid 4889 trên exon 7 của gen CYP1A1. Đã có nhiều nghiên cứu về gen CYP1A1 cũng như mối liên quan giữa đa hình m2 của gen CYP1A1 với nhiều loại ung thư khác nhau như: ung thư phổi, tiền liệt tuyến, buồng trứng, vú,…nhưng lại chưa có nhiều nghiên cứu về ung thư gan và các nghiên cứu này chưa đi đến sự thống nhất trong các kết luận. Hơn nữa, hiện nay ở Việt Nam chưa có báo cáo nào về mối liên quan giữa đa hình m2 của gen CYP1A1 với ung thư gan.
Do đó đề tài nghiên cứu: “Phân tích đa hình A4889G của gen CYP1A1bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên bệnh nhân ung thư gan” được tiến hành với mục tiêu: Bước đầu phân tích được tính đa hình A4889G của gen CYP1A1 trên một số mẫu ung thư gan bằng kỹ thuật RFLP-PCR. Nghiên cứu này là một bước nhỏ cho những nghiên cứu lớn sau này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Ashwin Ananthakrishnan, Veena Gogineni and Kia Saeian. (Mar 2006). Epidemiology of Primary and Secondary Liver Cancers. Semin Intervent Radiol, 23(1), 47-63.
2.Lozano. R et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet, 380(9859), 2095-2128.
3.Liver cancer incidence statistics, www.cancerresearchuk.org
4.Đoàn Hữu Nghị (2007), Ung thư gan nguyên phát, chẩn đoán và điều trị, Nhà xuất bản y học.
5.Lê Thị Thúy (2012), Nghiên cứu mức độ phiên mã gen Activation induced cytidine deaminase (AID) và tỷ lệ đột biến gen P53 trong ung thư dạ dày và ung thư gan nguyên phát, Trường Đại học Y Hà Nội.
6.Nguyễn Quang Quyền, Bài giảng Giải Phau học, trang 133.
7.Ung thư gan, www.dieutri.vn
8.Amed I, Lobo D.N. (January 2009). Malignant tumors of the liver. Surgery (Oxford), 27(1), 30-37.
9.Emre S, McKenna GJ. (December 2004). Liver tumors in children. Pediatric transplantation, 8(6), 632-638.
10.Risks and causes of liver cancer, www.cancerresearchuk. org
11.Arzumanyan A, Reis HM, Feitelson MA. (February 2013). Pathogenic mechanisms in HBV- and HCV-associated hepatocellular carcinoma. Nature reviews. Cancer, 13(2), 123-135.
12.Jeong SW, Jang JY, Chung RT. (December 2012). Hepatitis C virus and hepatocarcinogenesis. Clinical and molecular hepatology, 18(4), 347-356.
13.Ralphs S, Khan SA. (May 2013). The role of the hepatitis viruses in cholangiocarcinoma. Journal of viral hepatitis, 20(5), 297-305.
14.Kew MC. (March 2013). Hepatitis viruses (other than hepatitis B and C viruses) as causes of hepatocellular carcinoma: an update. Journal of viral hepatitis, 20(3), 149-157.
15.Chuang SC, La Vecchia C, Boffetta P. (Dec 1, 2009). Liver cancer: descriptive epidemiology and risk factors other than HBV and HCV infection. Cancer letters, 286(1), 9-14.
16.General Information About Adult Primary Liver Cancer.National Cancer Institute. Retrieved 13 January 2013.
17.Xin Wei Wang, Joe W. Grisham, Snorri S. Thorgeirsson, (8 November 2010), Molecular Genetics of Liver Neoplasia, 16-17, Springer Science & Business Media.
18.Liver Cancer: Estimated Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012. www.globocan.iarc.fr/Pages/fact sheets cancer.aspx.
19.Bozina N et al. (2009). Genetic polymorphism of CYP enzyms. Arg Hig Rada Toksikol, 60, 217-242.
20.Nelson D. (2003). Cytochromes P450 in humans. Retrieved May 9, 2005.
21.Agnes A. Walsh, Grazyna D. Szklarz and Emily E. Scott. (May 3 2013). Human Cytochrome P450 1A1 Structure and Utility in Understanding Drug and Xenobiotic Metabolism. J Biol Chem, 288(18), 12932-12943. Published online 2013 Mar 18.
22.Beresford AP. (1993). CYP1A1: friend or foe? Drug Metab Rev, 25(4), 503-517.
23.Vasilis P Androutsopoulos, Aristidis M Tsatsakis and Demetrios A Spandidos. (2009). Cytochrome P450 CYP1A1: wider roles in cancer progression and prevention. BMC Cancer, 9, 187.
24.Cheung C, Ma X, Krausz KW et al. (2001). Predicting the mutagenicity of tobacco-related N-nitrosamines in humans using 11 strains of Salmonella typhimurium YG7108, each coexpressing a form of human cytochrome P450 along with NADPH-cytochrome P450 reductase. Environ Mol Mutagenesis, 38, 339-346.
25.Seitz H.K., Stickel F. (2007). Molecular mechanisms of alcohol-mediated carcinogenesis. Nat Rev Cancer, 7(8), 599-612.
26.Crofts F, Taioli E, Trachman J et al. Functional significance of different human CYP1A1 genotypes. Carcinogenesis, 15(12), 2961-2963.
27.Bin Wu, Kang Liu, Huaxing Huang et al. (2013). MspI and Ile462Val Polymorphisms in CYP1A1 and Overall Cancer Risk: A Meta-Analysis. PLoS One, 8(12), 85166. Published online 2013 Dec 31.
28.B.W. Yu, L.Q. Zhang, X.L. Teng et al. (2015). Association between the CYP1A1 polymorphisms and hepatocellular carcinoma: a meta-analysis.
Genetics and Molecular Research, 14(1), 1076-1084.
29.Rui Li, Yin Yao Shugart, Weiping Zhou et al. (2009). Common genetic variations of the cytochrome P450 1A1 gene and risk of hepatocellular carcinoma in a Chinese population. European Journal of Cancer, 45, 1239-1247.
30.Regislaine Valeria Burim, Renata Canalle, Ana de Lourdes Candolo Martinelli and Catarina Satie Takahashi. (2004). Polymorphisms in glutathione S- transferases GSTM1, GSTT1 and GSTP1 and cytochromes P450 CYP2E1 and
CYP1A1 and susceptibility to cirrhosis or pancreatitis in alcoholics.
Mutagenesis, 19(4), 291-298.
31.Xiaoyan Yuan, Gangqiao Zhou, Yun Zhai et al. (December 2008). Lack of Association between the Functional Polymorphisms in the Estrogen- Metabolizing Genes and Risk for Hepatocellular Carcinoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 17, 3621.
32.M-W Yu, Y-H Chiu, S-Y Yang et al. (1999). Cytochrome P450 1A1 genetic polymorphisms and risk of hepatocellular carcinoma among chronic hepatitis B carriers. British Journal of Cancer, 80(3/4), 598-603.
33.Chang Liu, Zheng Jiang, Qian-xi Deng et al. (2014). Meta-analysis of Association Studies of CYP1A1 Genetic Polymorphisms with Digestive Tract Cancers Susceptibility in Chinese. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 15, 4689-4695.
34.Ingolf Cascorbi, Jurgen Brockmoller and Ivar Roots. (November 1 1996). A C4887A Polymorphism in Exon 7 of Human CYP1A1: Population Frequency, Mutation Linkages, and Impact on Lung Cancer Susceptibility. Cancer Research, 56, 4965-4969.
35.Suzana Makpol, Suhana Mamat, Zalinah Ahmad et al. (2005). Genetic Polymorphisms in CYP1A1 (m1), (m2), (m4) and CYP2A6 and Susceptibility to Hepatocellular Carcinoma in a Malaysian Study Population. Malaysian Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 12, 31-40.
36.Andrzej Roszak, Margarita Lianeri, Anna Sowinska et al. (2014). CYP1A1 Ile462Val Polymorphism as a Risk Factor in Cervical Cancer Development in the Polish Population. Mol Diagn Ther, 18(4), 445-450. Published online 2014 Mar 14.
37.Tạ Thành Văn (2010), PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất bản Y học.
38.Rasmussen H.B. (2012). Restriction Fragment Length Polymorphin Analysis of PCR-RFLP and Gel Electrophoresis-Valuable Tool for Genotyping and Genetic Fingerprinting. Gel Electrophoresis-Principles and Basics, 315-325.
39.BsrDI, www.neb.com/products/r0574-bsrdi.
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH
ĐẶT VẤN ĐỀ1
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN3
1.1.Tổng quan về ung thư gan3
1.1.1.Dịch tễ học3
1.1.2.Ung thư gan và phân loại5
1.1.3.Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ6
1.2.Tổng quan về gen CYP1A18
1.2.1.Hệ thống enzym CYP (Cytochrome P450)8
1.2.2.Vị trí, cấu trúc phân tử9
1.2.3.Chức năng, vai trò10
1.3.Đa hình thái gen CYP1A1 trong bệnh ung thư gan12
1.3.1.Khái niệm đa hình đơn nucleotid (SNP)12
1.3.2.Tính đa hình của gen CYP1A113
1.3.3.Đa hình A4889G của gen CYP1A117
1.4.Kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đa hình A4889G của gen CYP1A118
1.4.1. Kỹ thuật RFLP-PCR18
1.4.2.Kỹ thuật giải trình tự gen21
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU23
2.1.Đối tượng nghiên cứu23
2.2.Địa điểm và thời gian nghiên cứu23
2.3.Đạo đức trong nghiên cứu23
2.4. Phương pháp nghiên cứu23
2.5.Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu24
2.5.1.Dụng cụ, trang thiết bị24
2.5.2.Hóa chất25
2.6.Quy trình kỹ thuật26
2.6.1.Lấy mẫu và bảo quản26
2.6.2.Tách chiết DNA từ máu toàn phần27
2.6.3. Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA28
2.6.4.Kỹ thuật PCR khuếch đại một đoạn gen CYP1A129
2.6.5.Kỹ thuật RFLP-PCR phát hiện đa hình A4889G của gen CYP1A131
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU34
3.1.Kết quả tách chiết DNA34
3.1.1.Kết quả đo OD34
3.1.2.Kết quả điện di DNA tổng số36
3.2.Kết quả PCR khuếch đại đoạn gen CYP1A136
3.3.Kết quả RFLP-PCR37
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN41
4.1.Kết quả tách chiết DNA41
4.2.Kết quả PCR khuếch đại một đoạn gen CYP1A142
4.3.Kết quả phát hiện đa hình A4889G của gen CYP1A144
KẾT LUẬN47
TÀI LIỆU THAM KHẢO1
Hy vọng sẽ giúp ích cho các bạn, cũng như mở ra con đường nghiên cứu, tiếp cận được luồng thông tin hữu ích và chính xác nhất