Phân tích đa hình C4887A của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên bệnh nhân ung thư phổi
Luận văn Phân tích đa hình C4887A của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên bệnh nhân ung thư phổi.Ung thư đã và đang là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Ung thư phổi là bệnh lý ác tính thường gặp nhất ở nhiều quốc gia, có tỉ lệ tử vong cao và có xu hướng gia tăng liên tục trong những năm gần đây. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2014, có xấp xỉ khoảng 14 triệu ca mới mắc mỗi năm và 8,2 triệu ca tử vong do ung thư năm 2012, trong đó số ca tử vong do ung thư phổi là 1,59 triệu người, chiếm tỉ lệ cao nhất trong các bệnh ung thư [1].
Ung thư phổi là bệnh có tiên lượng xấu. Điều trị ung thư phổi tuỳ thuộc vào giai đoạn và tình trạng sức khoẻ chung của bệnh nhân. Chẩn đoán sớm và các thuốc điều trị ngày càng có hiệu quả nhưng vẫn còn nhiều trường hợp ung thư phổi được chẩn đoán ở giai đoạn muộn dẫn đến việc điều trị tốn kém về kinh tế cho bệnh nhân mà hiệu quả điều trị lại thấp. Các yếu tố nguy cơ ngày càng cần được xác định rõ ràng hơn nhằm dự phòng và phát hiện sớm ung thư phổi, trong đó yếu tố di truyền đóng vai trò khá quan trọng đối với sự hình thành và phát triển ung thư.
Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành y sinh học phân tử, đã có nhiều phương pháp mới giúp cho việc chẩn đoán và phát hiện sớm một số loại ung thư nói chung và ung thư phổi nói riêng đã được ứng dụng. Nguyên tắc chung của phương pháp này là sử dụng các kỹ thuật phân tích DNA xác định các gen liên quan và có khả năng gây ung thư. Việc xác định các đa hình thái đơn nucleotid trên một số gen này có giá trị rất lớn trong đánh giá nguy cơ mắc bệnh ung thư thông qua sự phân bố kiểu gen của từng cá thể. Từ đó có thể đưa ra những biện pháp phòng tránh những yếu tố nguy cơ để ngăn cản sự hình thành và tiến triển ung thư, tiên lượng chẩn đoán sớm, theo dõi và điều trị có hiệu quả ngay từ đầu.
Tại Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu về ung thư phổi, nhưng tập trung chủ yếu về khía cạnh dịch tễ học, chẩn đoán mô bệnh học và phương pháp điều trị. Tuy nhiên những nghiên cứu về tính đa hình của gen ảnh hưởng đến bệnh ung thư phổi thì mới được triển khai thực hiện trong một vài năm trở lại đây.
Chính vì vậy, đề tài “Phân tích đa hình C4887A của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên bệnh nhân ung thư phổi” được tiến hành nhằm mục đích hoàn thiện kỹ thuật, để từ đó phục vụ cho những nghiên cứu có cỡ mẫu lớn hơn, với các mục tiêu cụ thể như sau:
1. Áp dụng kỹ thuật RFLP-PCR xác định tính đa hình C4887A của gen CYP1A1.
2. Bước đầu xác định tỉ lệ kiểu gen, tần số alen của các đa hình C4887A trên gen CYP1A1 ở bệnh nhân ung thư phổi và so sánh với người bình thường đối chứng.
TAI LIỆU THAM KHAO
1. Stewart BW, Wild CP, editors. (2014). World Cancer Report 2014. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer.
2. Centers for Disease Control and Prevention.(2014). http: //www.cdc .gov/
3. Ferlay J, Soerjomataram I, Ervik M, et al. F. GLOBOCAN 2012 v1.1, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 1.
4. Ngô Quý Châu, Chu Thị Hạnh, Nguyễn Thanh Hồi và cộng sự, (2009) Ung thư phổi., Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
5. Doll, R.; Hill, A. B. (1950). Smoking and Carcinoma of the Lung. BMJ 2 (4682): 739-748.
6. Doll, R. (1955). Mortality from lung cancer in asbestos workers. British journal of industrial medicine. 12 (2): 81-86.
7. Vaporciyan, AA; Nesbitt JC, Lee JS et al. (2000). Cancer Medicine. B C Decker. tr. 1227-1292.
8. National Center for Biotechnology Information, United States National Library of Medicine. (2015). CYP1A1 cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1 [Homo sapiens (human)]. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1543
9. Agnes A.W, Grazyna D.S, Emily E. Scott. (2013). Human Cytochrome P450 1A1 Structure and Utility In Understanding Drug and Xenobiotic Metabolism. Human CYP1A1 Structure and Use in Understanding Metabolism.
10. Kawajiri K (1999). CYP1A1. IARC Scientific Publications. 148, 159-72.
11. The Human Gene Compenium. (2014). CYP1A1 Gene protein-coding. http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=CYP1A1
12. Berka K1, Hendrychová T, Anzenbacher P, Otyepka M (2011). Membrane position of ibuprofen agrees with suggested access path entrance
to cytochrome P450 2C9 active site. Journal of Physical Chemistry A. 115 (41), 11248-55.
13. Beresford AP (1993). CYP1AP. friend or foe?. Drug Metabolism Reviews. 25 (4), 503-17.
14. C.S.Jose, A.Cabanillas, J.Benitez, et al. (2010). CYP1A1 gene polymorphisms increase lung cancer risk in a high-incidence region of Spain: a case control study.BMC Cancer. 10, 463.
15. M.Esteller, et al. (1997). Germ line polymorphisms in cytochrome-450 1A1 (C4887A CYP1A1) and methylenetertrahydrofolate reductase (MTHFR) genes and endometrial cancer susceptibility. Carcinogensis. 18, 2307-2311.
16. Barreiro LB, Laval G, Quach H, et al. (2008). Natural selection has driven population differentiation in modern humans. Nature Genetics. 40 (3), 340¬345.
17. National Center for Biotechnology Information, United States National Library of Medicine. (2014). NCBI dbSNP build 142 for human.
http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/mailman/pipermail/db snp – announce/2014q4/000147.html
18. Petersen DD, McKinney CE, Ikeya K, et al. (1991). Human CYP1A1 gene: cosegregation of the enzyme inducibility phenotype and an RFLP. American Journal of Human Genetics. 48 (4), 720-725.
19. Cosma G, Crofts F, Taioli E, et al. (1993). Relationship between genotype and function of the human CYP1A1 gene. Journal of Toxicology and Environmental Health. 40, (2-3), 309-16.
20. Crofts F, Taioli E, Trachman J, et al. (1994). Functional significance of different human CYP1A1 genotypes. Carcinogenesis. 15 (12): 2961-2963.
21. Kiyohara C, Hirohata T, Inutsuka S (1996). The relationship between aryl hydrocarbon hydroxylase and polymorphisms of the CYP1A1 gene. Japanese Journal of Cancer Research. 87 (1): 18-24.
22. Cascorbi I, Brockmoller J, Roots I. (1996). A C4887A polymorphism in Exon 7 of Human CYP1A1: Population Frequency, Mutation Linkages, and Impact on Lung Cancer Susceptibility. Cancer Res. 56, 4965-4969.
23. Gottfried Kellermann, Ph.D., Charles R. Shaw, et al. (1973). Aryl Hydrocarbon Hydroxylase Inducibility and Bronchogenic Carcinoma. N Engl J Med. 289, 934-937.
24. D.S. Early, F. Gao, C.Y.Ha, et al. (2010) The Association Between a Functional CYP1A1 Polymorphism and Colorectal Neoplasia Risk in Post Menopausal Women. Dig Dis Sci. 55(10).
25. Grunenwald H. (2003). Optimization of Polymerase Chain Reactions.
Methods in Molecular Biology: PCR Protocol 2rd„ 226, 89-99.
26. Saiki, R. K. (1989). The design and optimization of the PCR, in PCR Technology (Erlich, H. A., ed), Stockton Press, NewYork, pp 7-16.
27. Nan Song, Wen Tan, Deyin Xing, et al. (2001) CYP1A1 polymorphism and risk of lung cancer in relation to tobacco smoking: a case-control study in China. Carcinogensis. 22, 11-16.
28. Sheikh M Shaffi, Mohd Amin Shah, Imtiyaz Ahmad Bhat,et al. (2009). CYP1A1 Polymorphisms and Risk of Lung Cancer in the Ethnic Kashmiri Population. Asian Pacific J Cancer Prev. 10, 651-656.
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tổng quan về bệnh ung thư phổi 3
1.1.1. Dịch tễ học bệnh ung thư phổi 3
1.1.1.1. Tình hình bệnh ung thư phổi trên thế giới 3
1.1.1.2. Tình hình bệnh ung thư phổi ở Việt Nam 4
1.1.1.3. Các yếu tố nguy cơ 5
1.1.2. Đặc điểm bệnh ung thư phổi 6
1.1.2.1. Phân loại ung thư phổi 6
1.1.2.2. Triệu chứng lâm sàng 7
1.1.2.3. Chẩn đoán ung thư phổi 7
1.1.2.4. Điều trị bệnh ung thư phổi 8
1.2. Tổng quan về gen CYP1A1 9
1.2.1. Vị trí và cấu trúc 9
1.2.2. Chức năng 9
1.2.3. Tính đa hình thái của gen CYP1A1 11
1.2.3.1. Hiện tượng SNP 11
1.2.3.2. Tính đa hình thái của gen CYP1A1 13
1.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử được dùng trong phát hiện đa hình
của gen CYP1A1 14
1.3.1. Kỹ thuật RFLP-PCR 14
1.3.1.1. Nguyên lý 14
1.3.1.2. Kỹ thuật PCR 14
1.3.1.3. Kỹ thuật RFLP 16
1.3.2. Kỹ thuật giải trình tự gen 17
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. Thời gian và địa điểm 18
2.2. Đối tượng nghiên cứu 18
2.3. Dụng cụ, trang thiết bị, hóa chất nghiên cứu 18
2.3.1. Dụng cụ, trang thiết bị 18
2.3.2. Hóa chất nghiên cứu 19
2.4. Phương pháp nghiên cứu 21
2.4.1. Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi bằng phương pháp
Phenol/ Chloroform/Isoamylalcohol 22
2.4.2. Quy trình kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch DNA 23
2.4.2.1. Điện di DNA tổng số 23
2.4.2.2. Đo mật độ quang trên máy Nanodrop 1000 24
2.4.3. Quy trình khuếch đại gen (PCR) 25
2.4.4. Quy trình cắt với enzym cắt giới hạn (RFLP-PCR) 26
2.4.5. Quy trình giải trình tự gen 29
2.5. Đạo đức trong nghiên cứu 30
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31
3.1. Kết quả tách chiết DNA 31
3.2. Kết quả khuếch đại gen (PCR) 34
3.3. Kết quả cắt với enzym cắt giới hạn (RFLP-PCR) 35
3.4. Kết quả giải trình tự gen một số mẫu 37
3.5. Kết quả xác định tính đa hình C4887A của gen CYP1A1 trên bệnh
nhân ung thư phổi 38
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 41
4.1. Đặc điểm nhóm nghiên cứu 41
4.2. Kết quả tách chiết DNA 41
4.3. Kết quả khuếch đại gen (PCR) 43
4.4. Kết quả cắt với enzym cắt giới hạn (RFLP-PCR) 44
4.5. Kết quả xác định đa hình C4887A trên bệnh nhân ung thư phổi và
một số nghiên cứu trên thế giới 45
KẾT LUẬN 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO