Phân tích đa hình G4268C của gen CYP2D6 bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên một số mẫu ung thư phổi
Luận văn Phân tích đa hình G4268C của gen CYP2D6 bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên một số mẫu ung thư phổi.Ung thư phổi (UTP) đã và đang là căn bệnh ung thư phổ biến nhất trên toàn thế giới. Tính đến năm 2012, trên thế giới ước tính có khoảng 1,8 triệu trường hợp mắc mới và tỉ lệ tử vong do ung thư phổi đứng hàng đầu trong các bệnh ung thư với 1,59 triệu trường hợp tử vong. Tại Việt Nam, cơ quan Quốc tế Nghiên cứu Ung thư (IARC) đã đưa ra những con số chính thức về tình hình ung thư phổi: cứ 100,000 người thì có 25,21 trường hợp mắc mới và tổng số trong năm 2012 có tới 21,865 bệnh nhân mắc ung thư phổi [1]. Tỷ lệ bệnh nhân mắc mới ở nước ta đang tăng nhanh, đứng thứ hai (17,5%) chỉ sau ung thư gan (17,6%) [2].
Các phương pháp chẩn đoán hiện nay như chụp X-quang ngực, nội soi phế quản,… góp phần hỗ trợ trong việc tiên lượng ung thư phổi nhưng vẫn còn nhiều trường hợp được chẩn đoán ở giai đoạn muộn dẫn đến việc điều trị tốn kém mà hiệu quả điều trị lại thấp. Hiện nay, với sự phát triển các kỹ thuật y sinh học phân tử thì đã có nhiều kỹ thuật hỗ trợ cho việc xác định sớm và phòng ngừa một số loại ung thư nói chung và UTP nói riêng. Một trong số đó là phương pháp phân tích đa hình thái trên một số gen chủ chốt giúp hỗ trợ việc xác định nguy cơ gây UTP [3].
Những gen đã được công bố là tính đa hình có liên quan đến nguy cơ UTP là CYP2D6. Cytochrome P450 2D6 (CYP2D6) là gen mã hóa cho enzym thuộc họ Cytochrome P450, là một trong những enzym quan trọng liên quan đến sự trao đổi xenobiotic trong cơ thể, trong đó có các chất gây ung thư. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng: có một số allele nhất định dẫn đến kiểu hình chuyển hóa chậm, đặc trưng bởi giảm khả năng chuyển hóa các chất có thể làm tăng nguy cơ bị ung thư.
Từ những thực tế đó, đề tài: “Phân tích đa hình G4268C của gen CYP2D6 bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên một số mẫu ung thư phổi ” được tiến hành với mục tiêu: Xác định được tính đa hình G4268C của gen CYP2D6 trên một số mẫu bệnh nhân UTP ở Việt Nam. Đây là bước đầu nhằm phục vụ cho các nghiên cứu sau này.
KÉT LUẬN
Các kết quả thu được cho thấy kỹ thuật RFLP-PCR xác định được tính đa hình G4268C của gen CYP2D6. Với kết quả ban đầu:
+ Tỷ lệ kiểu gen C/C ở nhóm bệnh 9/30 và ở nhóm chứng 19/30.
+ Tỷ lệ kiểu gen G/C ở nhóm bệnh 17/30 và ở nhóm chứng 8/30.
+ Tỷ lệ kiểu gen G/G ở nhóm bệnh 4/30 và ở nhóm chứng 3/30.
Tài Liệu Tham Khảo
1. Ferlay J, E.M., Dikshit R, et al. (2013). GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11.
2. Thomas., G.V.a.P.A, (2014) Gonzalo Varela and Pascal Alexandre Thomas. J Thorac Dis, 6.
3. Verma, A.M.a.M, (2010) Cancer Biomarkers: Are We Ready for the Prime Time? Cancers (Basel): p. 190-208.
4. Cohen MH, C.P, Fossieck BE Jr et al, (2010) Intensive chemotherapy of small cell bronchogenic carcinoma. Cancer Treat Rep: p. 394-354.
5. WHO, ( 2012) WHO Cancer factsheet.
6. Ferlay J, S.H, Bray F, et al, (2010) Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer: p. 127.
7. http: //seer.cancer.gov/statfacts/html/lungb .html
8. Thuấn, T.V, (2005) Một số đặc điểm dịch tễ học qua ghi nhận ung thư tại Hà Nội.
9. Lê Đình Roanh, (2008) Giải phẫu bệnh. Nhà xuất bản Y học.
10. Horn, L; Pao W, Johnson DH (2012). “Chapter 89”. In Longo, DL; Kasper, DL; Jameson, JL; Fauci, AS; Hauser, SL; Loscalzo, J. Harrison’s Principles of Internal Medicine (18th ed.). McGraw-Hill .
11. Travis W.D., Colby T.V., Corrin B., Shimosato Y., Brambilla E. In Collaboration with Sobin LH and Pathologists from 14 Countries (1999), “World Heath Organization International Histological Classification of Tumours, Histological Typing of Lung and Pleural Tumours”, 3rd Edn. Springer-Verlag.
12. Jemal A, Bray F, Ward E et al (2011), “Global cancer statistics”, CA Cancer J Clin; 61(2), pp.69-90.
13. Nguyễn Bá Đức (2006), Nghiên cứu dịch tễ học, chẩn đoán, điều trị phòng chống một số bệnh ung thư ở Việt Nam, Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật: p.34-138.
14. http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=CYP2D6
15. Han XM, Z.H, (2000) Polymorphism of CYP450 and cancer susceptibility. Acta Pharmacol Sin: p. 673-679.
16. http://en.wikipedia.org/wiki/Single-nucleotide_polymorphism
17. Tomohiro Suzumura, T.K., corresponding author, Shinzoh Kudoh, Kanako Umekawa, Misato Nagata, Kuniomi Matsuura, Hidenori Tanaka, Shigeki Mitsuoka,Naruo Yoshimura, Yukimi Kira, Toshiyuki Nakai, and Kazuto Hirata, (2012), Reduced CYP2D6 function is associated with gefitinib-induced rash in patients with non-small cell lung cancer.
18. Single Nucleotide Polymorphisms of CYP2D6 Gene G4268C C188T and ERCC1 Gene C8092A and Their Genetic Susceptibility to Lung cancer. China Papers.
19. Gail L. Shaw, R.T.F., James N. Frame, et al, (1998) Genetic Polymorphism of CYP2D6 and Lung cancer Risk.
20. Grunenwald, H, (2003) Optimization of Polymerase Chain Reactions. Methods in Molecular Biology, 226: p. 89-99.
21. Rasmussen, H.B, (2012) Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of PCR-Amplified Fragments (RFLP-PCR) and Gel Electrophoresis – Valuable Tool for Genotyping and Genetic Fingerprinting. Gel Electrophoresis – Principles and Basics: p. 315¬325.
22. http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1 : TỔNG QUAN 3
1.1 Dịch tễ ung thư phổi 3
1.2 Đặc điểm ung thư phổi 4
1.3 Cơ chế phân tử trong bệnh ung thư phổi 6
1.3.1 Các yếu tố nguy cơ 6
1.3.2 Cơ chế bệnh sinh ung thư phổi 6
1.4 Sơ lược về gen CYP2D6 9
1.4.1 Vị trí và cấu trúc gen CYP2D6 9
1.4.2 Chức năng của Protein CYP2D6 10
1.5 Đa hình nucleotid đơn 10
1.6 Một số phương pháp sinh học phân tử xác định SNP 13
1.6.1 Phương pháp RFLP-PCR 13
1.6.2 Phương pháp giải trình tự 16
1.7 Enzym giới hạn: 17
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1 Thời gian và địa điểm 18
2.2 Đối tượng nghiên cứu 18
2.3 Phương pháp nghiên cứu 18
2.4 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 19
2.4.1 Dụng cụ và trang thiết bị 19
2.4.2 Hóa chất 19
2.5 Các phương pháp và quy trình kĩ thuật 21
2.5.1 Thu thập mẫu 21
2.5.2 Tách chiết DNA 21
2.5.3 Khuếch đại đoạn gen CYP2D6 có chứa SNP G4268C bằng phương
pháp PCR 23
2.5.4 Quy trình điện di DNA tổng số 24
2.5.5 Quy trình điện di sản phẩm PCR 25
2.5.6 Quy trình điện di sản phẩm cắt enzym 25
2.5.7 Giải trình tự gen đoạn gen CYP2D6 theo phương pháp Sanger 26
2.5.8 Phương pháp cắt enzym 26
2.6 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 27
Chương 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29
3.1 Kết quả tách chiết DNA 29
3.2 Kết quả PCR khuếch đại exon 9 của gen CYP2D6 31
3.3 Kết quả cắt enzym của đoạn gen CYP2D6 32
3.4 Kết quả giải trình tự kiểm tra cắt enzym 33
3.5 Phân tích kết quả xác định tính đa hình của G4268C trên đoạn gen
CYP2D6 34
Chương 4 : BÀN LUẬN 36
4.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu 36
4.2 Kết quả tách chiết DNA 36
4.3 Kết quả PCR 38
4.4 ‘Kết quả cắt enzym 39
4.5 Kết quả phân tích SNP G4268C của đoạn gen CYP2D6 40
KẾT LUẬN 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO 43
Bảng 1.1. Một số dạng SNPs của gen CYP2D6 12
Bảng 1.2. Vị trí cắt của một số enzym giới hạn 17
Bảng 3.1. Kết quả đo OD của các mẫu DNA sau khi tách chiết từ máu ngoại
vi của các đối tượng nghiên cứu 30
Bảng 3.2. Tỉ lệ kiểu gen và nguy cơ với UTP 35
Bảng 3.3. Tần số Allele với UTP 35
Bảng 4.1. So sánh tỷ lệ Allele của CYP2D6 ở một số nghiên cứu thế giới … 41
Hình 1.1. Tỉ lệ mắc UTP ở nam giới trên thế giới năm 2012 4
Hình 1.2. Cơ chế sinh ung thư phổi 8
Hình 1.3. Vị trí của gen CYP2D6 trên nhiễm sắc thể 22 9
Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc gen CYP2D6 và vị trí một số SNP 9
Hình 1.5. Minh họa đa hình nucleotid đơn 11
Hình 1.6. Minh họa phương pháp PCR 14
Hình 3.1.Minh họa đo OD của mẫu DNA tách chiết bằng máy Nanodrop
1000 29
Hình 3.2. Kết quả điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,8% 31
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% 32
Hình 3.4. Điện di sản phẩm cắt enzym trên gel agarose 3% 33
Hình 3.5. Phân tích kết quả giải trình tự bằng phần mềm CLC Main Workbench