Phân tích đa hình T5639C của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên một số mẫu ung thư phổi
Luận văn Phân tích đa hình T5639C của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên một số mẫu ung thư phổi.Hiện nay, ung thư đã trở thành một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Theo thống kê của Quỹ nghiên cứu ung thư thế giới (World Cancer Research Fund International) thì năm 2010 trên toàn thế giới ước tính có khoảng 1,41 triệu người mắc các bệnh ung thư và trong tương lai số người mắc, tử vong được dự đoán sẽ ngày càng tăng [1]. Ung thư phổi là loại ung thư có tỷ lệ mắc và tử vong hàng đầu ở cả hai giới. Hầu hết bệnh nhân ung thư phổi được chẩn đoán ở giai đoạn muộn, khi không thể phẫu thuật loại bỏ khối u mà chỉ có thể điều trị bằng hoá trị hay xạ trị. Tuy nhiên hai phương pháp này thường cho kết quả hết sức hạn chế, đồng thời gây nhiều tác dụng phụ ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng sống của người bệnh. Người bệnh có tiên lượng không tốt, thường tử vong sau 6 tháng đến 2 năm kể từ khi phát hiện bệnh. Vì vậy, giảm thiểu yếu tố nguy cơ, phát hiện sớm bằng các kỹ thuật sinh học phân tử luôn là một nhu cầu vô cùng quan trọng và cấp thiết để giảm tỉ lệ mắc bệnh ung thư phổi ở Việt Nam và toàn thế giới.
Gen CYP1A1 nằm ở vị trí 15q24.1 của nhiễm sắc thể số 15, mã hóa cho enzym CYP1A1 là một cấu phần của Cytochrom P450 tham gia quá trình oxi hóa nội bào, enzym này có vai trò chủ yếu trong việc hoạt hóa các hợp chất gây ung thư, thuốc, chất ô nhiễm từ môi trường của quá trình đào thải các chất độc ra khỏi cơ thể [2].
Nhiều kết quả nghiên cứu đã phát hiện ra một số đa hình nucleotid đơn (Single nucleotide polymorphism-SNPs) ở vùng mã hóa và không mã hóa trên gen CYP1A1 có liên quan tới sự phát sinh các loại bệnh. Một số SNP ở vùng mã hóa của gen gây biến đổi trình tự acid amin của protein từ đó làm thay đổi chức năng chuyển hóa của enzym CYP1A1, có thể phát sinh ra bệnh lý trong đó có ung thư phổi [3]. Một số đa hình trên gen CYP1A1 được biết đến như đa hình ml T6235C ở vùng đầu 3’, đa hình m2 A4889G ở exon 7 làm thay đổi acid amin Isoleucin thành Valin ở codon 462, đa hình m4 C4887A làm thay đổi acid amin Threonin thành Asparagin ở codon 461, trong đó đa hình m2 và ml đã được chứng minh có liên quan tới nguy cơ mắc ung thư phổi ở người Nhật Bản [4], [47].
Đa hình T5639C (m3) gây sự thay thế nucleotid T bằng C, được tìm thấy vị trí nuleotid thứ 5639 ở phần không mã hóa đầu 3’ trên gen CYP1A1, đa hình này được xác định đầu tiên bởi Crofts F, Cosma và cộng sự vào năm 1993. Đa hình m3 này mới chỉ phát hiện ở người Mỹ gốc Phi và liên quan tới tăng nguy cơ mắc ung thư phổi biểu mô tuyến nhưng chưa có nghiên cứu nào phát hiện đa hình này xuất hiện ở quần thể người châu Âu, châu Á [5], Đồng thời chưa có nghiên cứu nào xác định tần suất xuất hiện cũng như mối liên quan của đa hình này đối với bệnh ung thư phổi ở quần thể người Việt Nam.
Vì vậy, đề tài “ Phân tích đa hình T5639C của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên một số mẫu ung thư phổi” được tiến hành với các mục tiêu sau:
1. Áp dụng quy trình kỹ thuật RFLP-PCR để xác định đa hình T5639C của gen CYP1A1 trên bệnh nhân ung thư phổi.
2. Bước đầu xác định tính đa hình T5639C của gen CYP1A1 trên một số mẫu ung thư phổi so sánh với đối chứng.
ĐẶT VẤN ĐỀ Phân tích đa hình T5639C của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên một số mẫu ung thư phổi
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1 Tổng quan về ung thư phổi 3
1.1.1 Dịch tễ học 3
1.1.2 Các yếu tố nguy cơ và nguyên nhân gây ung thư phổi 4
1.1.3 Triệu chứng và dấu hiệu của ung thư phổi 7
1.1.4 Chẩn đoán và phân loại ung thư phổi 8
1.1.5 Điều trị ung thư phổi 9
1.2 Tổng quan về gen CYP1A1 ở người 10
1.2.1 Vị trí và cấu trúc của gen CYP1A1 10
1.2.2 Vai trò của enzym CYP1A1 trong cơ thể 11
1.2.3 Tính đa hình của gen CYP1A1 13
1.3 Kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện tính đa hình T5639C trên gen
CYP1A1 15
1.3.1 Kỹ thuật PCR 15
1.3.2 Kỹ thuật RFLP-PCR 18
1.3.3 Kỹ thuật giải trình tự gen 20
CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1 Thời gian và địa điểm 21
2.2 Đối tượng nghiên cứu 21
2.3 Khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu 21
2.4 Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu 21
2.4.1 Trang thiết bị 21
2.4.2 Dụng cụ 22
2.4.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu 22
2.5 Phương pháp nghiên cứu 23
2.5.1 Thiết kế nghiên cứu 24
2.5.2 Quy trình lấy mẫu 24
2.5.3 Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi 25
2.5.4 Khuếch đại đoạn gen chứa đa hình T5639C trên gen CYP1A1 …. 27
2.5.5 Kỹ thuật RFLP-PCR 28
CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31
3.1 Kết quả tách chiết DNA 31
3.2 Kết quả PCR khuếch đại đoạn gen đích chứa đa hình T5639C 33
3.3 Kết quả RFLP-PCR 33
3.4 Kết quả giải trình tự kiểm tra kiểu gen 35
3.5 Kết quả xác định tính đa hình T5639C của gen CYP1A1 36
CHƯƠNG 4 : BÀN LUẬN 38
4.1 Kết quả tách chiết DNA 38
4.2 Kết quả khuếch đại đoạn gen đích 39
4.3 Kết quả RFLP-PCR 40
4.4 Kết quả xác định tính đa hình T5639C của gen CYP1A1 41
KẾT LUẬN 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO