Phân tích đa hình T6235C của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên bệnh nhân ung thư gan
Luận văn Phân tích đa hình T6235C của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên bệnh nhân ung thư gan.Trong một vài năm trở lại đây, bệnh ung thư đã vượt qua tim mạch và rất nhiều loại bệnh nguy hiểm khác để trở thành một trong những bệnh lý có tỷ lệ tử vong cao nhất với số ca tử vong trên thế giới năm 2012 là hơn 8,2 triệu ca. Một trong những ung thư nguy hiểm và phổ biến chính là ung thư gan với tỉ lệ mắc hàng năm ước tính khoảng 780 nghìn ca và hơn 740 nghìn ca tử vong năm 2012. Bệnh xuất hiện trên cả nam và nữ giới tuy nhiên tỷ lệ ở nam giới cao hơn nhiều do gắn liền với thói quen uống rượu, các đồ uống có cồn và thuốc lá. Đây cũng chính là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến ung thư gan, bệnh đứng đầu về tỷ lệ tử vong do ung thư ở Việt Nam.
Ở giai đoạn đầu rất khó để nhận biết ung thư gan với các triệu chứng lâm sàng, các khối u thường âm thầm phát triển bệnh nhân rất khó nhận ra và khi các triệu chứng đã xuất hiện một cách rõ rệt thì khối u cũng đã phát triển lớn, người bệnh đã ở giai đoạn nguy hiểm. Bệnh nhân sẽ tử vong rất nhanh chỉ sau 3-6 tháng kể từ khi mắc bệnh. Ở Việt Nam phần lớn các bệnh nhân ung thư gan phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn, bệnh không còn khả năng điều trị triệt để, rất ít người có khả năng phẫu thuật.
Tuy nhiên xét trên góc độ bệnh học phân tử, ung thư gan là căn bệnh ác tính hình thành do sự tăng sinh của các tế bào gan phân chia một cách không kiểm soát, bản chất ung thư liên quan đến các biến đổi trên DNA làm sai hỏng quá trình nhân lên của tế bào bình thường. Nguyên nhân do đột biến của các gen sinh ung thư (oncogene) như: Họ gen ras, EGFR, b – raf, một phần họ gen CYPs; hay gen ức chế sinh ung thư (tumor suppressor gene) như Gen p16, FHIT, p53…
Trong các CYPs và đặc biệt là nhóm 1-3 thì CYP1A1 là enzym chính hoạt hóa các chất gây ung thư như nicotine, các hydrocacbon có nhân thơm, các chất nhóm xinobiotic. Khi mức độ biểu hiện và hoạt tính của các enzym này được tăng cường sẽ làm tăng khả năng hoạt hóa các chất gây ung thư.
Các đa hình thái đơn nucleotide (SNP – Single Nucleotide Polymorphism) là các đa dạng về trình tự thông tin di truyền có tần suất lớn (trên 1%) trong một quần thể người so với trình tự xác định của quần thể đó. Nghiên cứu tính đa hình thái ml của gen CYP1A1 cho thấy đa hình thái đơn nucleotide có liên quan đến tần suất xuất hiện bệnh ung thư gan. Việc xác định các đa hình này trong quần thể người Việt Nam là một nhiệm vụ cần thiết.
Dựa vào những thực tế trên, để góp phần hiểu rõ hơn về mối liên quan giữa giữa đột biến đa hình thái đơn ml (T6235C) của gen CYP1A1 và một số yếu tố nguy cơ của bệnh ung thư gan, đề tài “Phân tích đa hình T6235C của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên bệnh nhân ung thư gan” được tiến hành với 2 mục tiêu:
1. Áp dụng quy trình kỹ thuật RFLP-PCR xác định tính đa hình T6325C của gen CYP1A1.
2. Bước đầu xác định tính đa hình T6235C trên một số mẫu bệnh nhân ung thư gan so sánh với mẫu đối chứng.
TAI LIỆU THAM KHAO Phân tích đa hình T6235C của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên bệnh nhân ung thư gan
1. Leong A.S.Y., (1999), “Epidemiology, risk factors, etiology,
premalignant lesions and carcinogenesis”, in: hepatocellular carcinoma: Diagnosis, investigation and mangament, Published by Arnold, London, 1-17.
2. Jemal A, Bray F, Center MM, et al (2011) : “global cancer statistics”, CA Cancer Jclin” 61.
3. WHO-IARC (2010). Liver Cancer Incidence and Mortality Worldwide in 2008 Summary, Globocan 2008 Cancer Fact Sheet.
4. Long, Đ.V., Ung thư biểu mô tế bào gan. Bài giảng bệnh học nội khoa. (2012): Trường đại học y Hà Nội.
5. Đoàn Hữu Nghị (2007). “Ung thư gan nguyên phát, chẩn đoán và điều trị”. Nhà xuất bản y học.
6. Goopman J.D., Hall A.J. (1992), “Molecular dosimetry of AF-N7- Guanin in human urine obtained in the Gambia, West Africa”, Cancer Epidemiol Biomarkers Prew, 1(3), 221-7.
7. Trương Thị Xuân Liên (1994), “Tình hình nhiễm virus viêm gan C tại TPHCM, luận án phó tiến sỹ khoa học y dược, TPHCM.
8. Bengtsson N.O., hardel L. (1986), “Porphyrias porphyrins and hepatocellurar cancer”, Br.J.cancer, 54, 115 – 17.
9. Ngô Qúy Châu, Nguyễn Lân Việt, Phạm Quang Vinh và cộng sự. (2012), bệnh học nội khoa. Nhà xuất bản y học, 2, 17-24.
10. Hashem B.E (2011). Hepatocellular Carcinoma. The New England Journal of Medicine, 365, 1118-1127.
11. Stickel F., Schuppan D., Hahn E.G., Seitz H.K. (2002). “Cocarcinogenic
effects of alcohol in hepatocarcinogenesis.” GUT, 51(1), 132-139.
12. Seitz H.K., Stickel F. (2007). “Molecular mechanisms of alcohol- mediated carcinogenesis”. Nat Rev Cancer, 7(8), 599-612.
13. Zakhari S. (2006). “Overview: How Is Alcohol Metabolized by the Body?” . Alcohol Research & Health, 29 (4), 245-254.
14. Guengerich FP (January 2008) “Cytochrome p450 and chemical toxicology”. Chem. Res. Toxicol., 21 (1): 70-83.
15. Chris C. Ogu , PharmD 1 và Jan L. MAXA , RPh (2000) ,.“ Drug interactions due to cytochrome P450”, 421-423.
16. TOM LYNCH, PharmD, AMY PRICE, MD (2007),. “The Effect of Cytochrome P450 Metabolism on Drug Response, Interactions, and Adverse Effects”, Eastern Virginia Medical School, Norfolk, Virginia 391-396.
17. http://www.ebi.ac.uk/interpro/potm/2006_10/Page1.htm
18. GeneLoc. (2009) Genomic Views for Cyp1A1 gene.
19. Gonzalez FJ, Nebert DW (1990). “Evolution of the P450 gene superfamily: animal-plant “warfare,” molecular drive, and human genetic differences in drug oxidation”. Trends Genet 6:182-186.
20. Nebert DW, Nelson DR, Coon MJ, Estabrook RW, Feyereisen R. Fujii- Kuriyama Y. Gonzalez FJ, et al (1991) “The P450 gene superfamily: update on new sequences, gene mapping, and recommended nomenclature”. DNA Cell Biol 10:1-14.
21. Hung R.J et al (2003) “CYP1A1 and GSTM1 genetic polymorphism and lung cancer risk in Caucasian non-smokers: a pooled analysis”. Carcinogenesis, 24, 5, 875-882.
Kazuko Nishio et al Kawai (2005) “Multiplex PCR with confronting two-pair primers for drug metabolizing enzyme polymorphisms”. Asian
Pacific Journal of Cancer Prevention, 6: 346-352.
23. Tạ Thành Văn. (2010). PCR và một số kỹ thuật sinh học phân tử.
24. AP, B. (1993) CYP1A1: friend or foe? Drug Metabolism Reviews,.
25. Lodovici, M. (2004), “Benzo(a)pyrene Diolepoxide (BPDE)- DNA Adduct Levels in Leukocytes of Smokers in Relation to Polymorphism of CYP1A1, GSTM1, GSTP1, GSTT1, and mEH”
26. Gaspari L. et al Taioli E. (2003) “Polymorphisms in CYP1A1, GSTM1 and lung cancer below the age of 45 years”. International Journal of Epidemiology, 60-63.
27. CYP1A1 allele nomenclature .http://www.cypalleles.ki.se/cyp1a1.htm (NCBI).
28. Curr Biol. (2008). “3’ UTRs are the primary regulators of gene expression in the C. Elegansgermline” 14-18, 1476-1482.
29. Steroids. (2002 Jun) .“AUUUA motifs in the 3’UTR of human glucocorticoid receptor alpha and beta mRNA destabilize mRNA and decrease receptor protein expression”, 67 (7): 627-36..
30. Yu MW, Yang SY, Chiu YH, Chiang YC, et al. (1999b). “A p53 genetic olymorphism as a modulator of hepatocellular carcinoma risk in relation to chronic liver disease, familial tendency, and cigarette smoking in hepatitis B carriers”. Hepatology 29: 697-702.
31. B.W. Yu1, L.Q. Zhang, Y. Zhang, L.B. Zou and H.Y. Yin,.(11/2014), “Association between the CYP1A1 polymorphisms and hepatocellular carcinoma: a meta-analysis”.
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH ẢNH
DANH MỤC BẢNG
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3
1.1. T ổng quan ung thư gan 3
1.1.1. Dịch tễ học 3
1.1.2. Các yếu tố nguy cơ gây ung thư gan 4
1.1.3. Dấu hiệu- triệu chứng nhận biết ung thư gan 6
1.2. Tổng quan gen CYP1A1 8
1.2.1. Cytochrome P450 (CYPs) 8
1.2.2. Vị trí – cấu trúc gen CYP1A1 9
1.2.3. Chức năng của gen CYP1A1 10
1.3. Tính đa hình gen CYP1A1 và đa hình T6235C 13
1.3.1. Hiện tượng SNP 13
1.3.2. Tính đa hình thái của gen CYP1A1 14
1.3.3. Đa hình T6235C gen CYP1A1 với ung thư gan 16
1.4. Các kỹ thuật sử dụng để phát hiện đa hình T6235C 16
1.4.1. Phương pháp RFLP-PCR 16
1.4.2. Điện di DNA 20
1.4.3. Phương pháp giải trình tự gen 21
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. Đối tượng nghiên cứu 22
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22
2.3. Đạo đức trong nghiên cứu 22
2.4. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 23
2.4.1. Dụng cụ, trang thiết bị 23
2.4.2. Hóa chất 23
2.5. Quy trình kỹ thuật 25
2.5.1. Lấy mẫu máu 25
2.5.2. Tách chiết DNA từ máu ngoại vi 25
2.5.3. Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA 27
2.5.4. Kỹ thuật PCR khuếch đại m1 gen CYP1A1 27
2.5.5. Kỹ thuật RFLP-PCR xác định tính đa hình T6235C của gen
CYP1A1 30
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35
3.1. Quy trình kỹ thuật 35
3.1.1. Kết quả tách chiết DNA 35
3.1.2. Kết quả chạy PCR khuếch đại DNA chứa đa hình T6235C của
gen CYP1A1 38
3.1.3. Kết quả xử lý với enzym cắt MspI 39
3.1.4. Kết quả giải trình tự vùng đa hình T6235C của gen CYP1A1 …. 40
3.2. Kết quả xác định tính đa hình T6235C trên bệnh nhân ung thư gan . 41
CHƯƠNG 4 : BÀN LUẬN 43
4.1. Quy trình kỹ thuật xác định tính đa hình T6235C 43
4.1.1. Kết quả tách chiết DNA 43
4.1.2. Điện di sản phẩm DNA 45
4.1.3. Kết quả PCR 46
4.1.4. Phản ứng cắt với enzym MspI 48
4.1.5. Giải trình tự gen 50
4.2. Kết quả phân tích đa hình T6235C gen CYP1A1 51
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO: 54