Phân tích tính đa hình A4889G của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên một số mẫu ung thư phổi
Luận Văn Phân tích tính đa hình A4889G của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên một số mẫu ung thư phổi.Những năm gần đây, bệnh lý ung thư đang trở thành vấn đề nhức nhối trên toàn cầu. Trong các bệnh lý ung thư, bệnh ung thư phổi (UTP) là bệnh lý với tỷ lệ mắc cũng như tỷ lệ tử vong đứng hàng đầu. Năm 2012, theo GLOBOCAN số UTP mới mắc trên toàn thế giới đã lên tới 1,8 triệu trường hợp, số tử vong do UTP là 1,6 triệu trường hợp mỗi năm, cao hơn tất cả các loại ung thư khác và có xu hướng gia tăng ở các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam.
Phương pháp điều trị tối ưu nhất với bệnh UTP là phẫu thuật lấy u ở giai đoạn sớm. Trong giai đoạn muộn bệnh nhân phải điều trị bằng các phương pháp khác như: xạ trị, hóa trị. Tuy nhiên hiệu quả của hai phương pháp này không cao và có nhiều tác dụng phụ nên bệnh nhân có tiên lượng không tốt và kéo dài thời gian sống thêm cho bệnh nhân không đáng kể. Do vậy, vấn đề xác định các yếu tố nguy cơ, từ đó có các biện pháp theo dõi, sàng lọc chẩn đoán sớm ngăn ngừa sự hình thành và tiến triển của UTP đóng vai trò vô cùng quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả điều trị, giảm nhẹ tác động và kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân UTP [1] [2]. Tuy nhiên, hiện nay, ở nước ta bệnh nhân thường được chẩn đoán UTP ở giai đoạn muộn do không tầm soát được đối tượng nguy cơ cao để có chiến lược theo dõi, sàng lọc bệnh nhân làm mất đi cơ hội điều trị triệt để bệnh UTP.
Ngày nay, với sự phát triển và ứng dụng mạnh mẽ của công nghệ sinh học phân tử vào y học, chúng ta đã tìm ra nhiều gen cũng như những biến đổi của chúng có mối liên quan mật thiết làm tăng nguy cơ mắc UTP. Những kiến thức ấy là cơ sở để xây dựng phương pháp sàng lọc chẩn đoán sớm, phát hiện đối tượng nguy cơ để đưa ra biện pháp phòng bệnh cũng như điều trị kịp thời cho bệnh nhân.
Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) là gen mã hóa cho enzym CYP1A1 thuộc họ cytochrome P450 tham gia vào quá trình chuyển hóa và đào thải các hợp chất xenobiotic, trong đó có chất gây ung thư [3]. Đa hình thái của gen này có thể làm thay đổi hoạt tính của enzym, qua đó gián tiếp ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa các chất gây ung thư và mức độ nhạy cảm với ung thư của cơ thể. Các nghiên cứu về gen CYP1A1 đã tìm ra nhiều đa hình thái đơn nucleotid (SNPs) đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh học của UTP cũng như các loại ung thư khác, trong đó có SNP A4889G (m2) [4]. Nhờ vào mối liên quan này, các nhà khoa học có thể sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để sàng lọc các đối tượng có nguy cơ cao, theo dõi phát hiện và chẩn đoán sớm UTP, đem lại cơ hội điều trị hiệu quả, nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân, đồng thời cũng là một biện pháp cần thiết để giảm nhẹ những thiệt hại về người và tốn kém về kinh tế trong điều trị UTP. Hiện nay, có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử có thể dùng để phát hiện SNP này như: giải trình tự gen, RLFP-PCR, ARMS-PCR, PCR-SSCP… mỗi kỹ thuật đều có ưu nhược điểm riêng và được áp dụng tại các cơ sở nghiên cứu và chẩn đoán phù hợp. Trong đó kỹ thuật RFLP-PCR là kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện cho kết quả tương đối chính xác với giá thành rẻ có thể áp dụng rộng rãi ở các cơ sở nghiên cứu và chẩn đoán trong cả nước.
Từ thực tiễn trên, đề tài nghiên cứu: “Phân tích tính đa hình A4889G của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên một số mẫu ung thư phổi” được thực hiện nhằm mục tiêu:
1. Hoàn thiện quy trình để phát hiện tính đa hình A4889G của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật RFLP-PCR.
2. Bước đầu đánh giá tỷ lệ đa hình A4889G của gen CYP1A1 trên bệnh nhân ung thư phổi và nhóm đối chứng.
Tài Liệu Tham Khảo Phân tích tính đa hình A4889G của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên một số mẫu ung thư phổi
1. Ngô Quý Châu, Nguyễn Lân Việt, Nguyễn Đạt Anh (2012), Bệnh học nội khoa, Nhà xuất bản y học, Hà Nội.
2. National Collaborating Centre for Cancer (UK) (2011), The Diagnosis and Treatment of Lung Cancer (Update), National Collaborating Centre for Cancer (UK), Cardiff (UK).
3. Nguyễn Thị Ngọc Dao (2011), Cytochrome P450, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và công nghệ, Hà Nội.
4. Aldrich M.C, Selvin S và Hansen H.M (2009). CYP1A1/2 Haplotypes and Lung Cancer and Assessment of Confounding by Population Stratification.
Cancer Res, 69(6), 2340-2348.
5. Forman D, Bray F và Brewster DH (2013), Cancer Incidence in Five Continents Vol. X.
6. Bray F, Ren JS và Masuyer E (2013). Estimates of global cancer prevalence for 27 sites in the adult population in 2008. Int J Cancer, 132, 1133-1145.
7. Nguyễn Bá Đức (2006). Tình hình bệnh ung thư ở Việt Nam giai đoạn 2001-2004. Tạp Chí Học Thực Hành, 9-17.
8. Hartmann W (1990). Expert assessment of asbestos-induced lung damage. Versicherungsmedizin Hrsg Von Verband Lebensversicher-Unternehm EV Verband Priv Krankenversicher EV, 42(2), 49-52.
9. Cheng D, Zhao L, Xu Y và cs (2015). K-Ras promotes the non-small lung cancer cells survival by cooperating with sirtuin 1 and p27 under ROS stimulation. Tumour Biol JInt Soc Oncodevelopmental Biol Med.
10. Mattioni M, Soddu S, Prodosmo A và cs (2015). Prognostic role of serum p53 antibodies in lung cancer. BMC Cancer, 15(1), 148.
11. Masson L.F, Sharp L, Cotton S.C và cs (2005). Cytochrome P-450 1A1 Gene Polymorphisms and Risk of Breast Cancer: A Huge Review. Am J Epidemiol, 161(10), 901-915.
12. Androutsopoulos V.P, Tsatsakis A.M và Spandidos D.A (2009). Cytochrome P450 CYP1A1: wider roles in cancer progression and prevention. BMC Cancer, 9(1), 187.
13. Walsh A.A, Szklarz G.D và Scott E.E (2013). Human cytochrome P450 1A1 structure and utility in understanding drug and xenobiotic metabolism. J Biol Chem, 288(18), 12932-12943.
14. Meunier B, Visser S.P và Shaik S (2004). Mechanism of Oxidation Reactions Catalyzed by Cytochrome P450 Enzymes. Chem Rev, 104(9), 3947-3980.
15. Kellermann G, Shaw C.R và Luyten-Kellerman M (1973). Aryl Hydrocarbon Hydroxylase Inducibility and Bronchogenic Carcinoma. N Engl J Med, 289(18), 934-937.
16. Lionel Gil M.A (2003). Genomics and proteomics offers new hopes towards a personalized approach to lung cancer prevention and treatment. Electron J Biotechnol, 6(3).
17. Nachman M.W (2001). Single nucleotide polymorphisms and recombination rate in humans. Trends Genet, 17(9), 481-485.
18. Tahira T, Kukita Y, Higasa K và cs (2009). Estimation of SNP allele frequencies by SSCP analysis of pooled DNA. Methods Mol Biol Clifton NJ, 578, 193-207.
19. Varela M.A và Amos W (2010). Heterogeneous distribution of SNPs in the human genome: microsatellites as predictors of nucleotide diversity and divergence. Genomics, 95(3), 151-159.
20. Jose C.S, Cabanillas A, Benitez J và cs (2010). CYP1A1 gene polymorphisms increase lung cancer risk in a high-incidence region of Spain: a case control study. BMC Cancer, 10(1), 1-7.
21. Cascorbi I, Brockmốller J, và Roots I (1996). A C4887A polymorphism in exon 7 of human CYP1A1: population frequency, mutation linkages, and impact on lung cancer susceptibility. Cancer Res, 56(21), 4965-4969.
22. Tạ Thành Văn (2010), PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất bản y học, Hà Nội.
23. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005), Sinh học phân tử, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội.
24. Lawyer, F, Stoffel, S và Saiki, R (1993). High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5’ to 3’ exonuclease activity.
PCR Methods Appl, 2, 275-287.
25. San Millan RM, Rementeria A và Garaizar J (2013). Online exercise for the design and simulation of PCR and PCR-RFLP experiments. BMC Res Notes, 6, 513.
26. Roberts RJ Restriction endonucleases. CRC Crit Rev Biochem, 4(2),123-164.
27. Saiki R.K, Scharf S, Faloona F và cs (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230(4732), 1350-1354.
28. Sugimura H, Wakai K, Genka K và cs (1998). Association of Ile462Val (Exon 7) polymorphism of cytochrome P450 IA1 with lung cancer in the Asian population: further evidence from a case-control study in Okinawa. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 7(5), 413-417.
ĐẶT VẤN ĐỀ Phân tích tính đa hình A4889G của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên một số mẫu ung thư phổi
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Ung thư phổi 3
1.1.1. Dịch tễ học 3
1.1.1.1. Tình hình ung thư phổi trên thế giới 3
1.1.1.2. Tình hình ung thư phổi ở Việt Nam 4
1.1.2. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ 5
1.1.3. Triệu chứng 6
1.1.3.1. Triệu chứng lâm sàng 6
1.1.3.2. Triệu chứng cận lâm sàng 7
1.1.4. Điều trị bệnh UTP 8
1.2. Vị trí và cấu trúc của gen CYP1A1 9
1.3. Cấu trúc và chức năng của protein CYP1A1 9
1.3.1. Cấu trúc 9
1.3.2. Chức năng 10
1.4. Tính đa hình thái đơn nucleotid của gen CYP1A1 12
1.4.1. Tính đa hình thái đơn nucleotid 12
1.4.2. Tính đa hình thái đơn nucleotid của gen CYP1A1 13
1.5. Kỹ thuật RFLP-PCR 14
1.5.1. Phản ứng PCR 14
1.5.2. Enzym giới hạn 16
1.5.3. Kỹ thuật RFLP-PCR 17
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. Đối tượng nghiên cứu 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu 19
2.3. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 21
2.3.1. Dụng cụ, trang thiết bị 21
2.3.2. Hóa chất 21
2.4. Quy trình kỹ thuật 22
2.4.1. Lấy mẫu máu 22
2.4.2 Tách chiết DNA từ máu ngoại vi 23
2.4.3. Kiểm tra độ tinh sạch của DNA 24
2.4.4. Khuếch đại DNA bằng phản ứng PCR 24
2.4.5. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR 25
2.4.6. Cắt sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn 26
2.4.7. Điện di kiểm tra sản phẩm sau khi cắt 26
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28
3.1. Kết quả tách chiết DNA 28
3.1.1. Kết quả đo OD 28
3.1.2. Kết quả điện di DNA tổng số 30
3.2. Kết quả khuếch đại gen bằng phản ứng PCR 31
3.3. Kết quả cắt sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn 32
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 37
4.1. Phương pháp và quy trình nghiên cứu 37
4.1.1. Kết quả tách chiết DNA 37
4.1.2. Kết quả phản ứng PCR 38
4.1.3. Kết quả phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn 41
4.2. So sánh kết quả giữa các nhóm nghiên cứu 42
KẾT LUẬN 44
Bp : Base pair.
DNA : Deoxyribonucleotid Acid.
dNTP : Deoxyribonucleotid-5-triphosphate.
A : Adenine.
T : Thymine.
G : Guanine.
C : Cytosine.
PCR : Polymerase chain reaction (phản ứng khuếch đại chuỗi gen).
RFLP : Restriction fragment length polymorphism (hiện tượng đa hình về
chiều dài của các đoạn DNA do enzym giới hạn tạo nên).
SNP : Single nucleotide polymorphism (hiện tượng đa hình thái đơn
nucleotid).
: Restriction enzym (enzym giới hạn).
: Cytochrome P450 1A1.
: World health organization (tổ chức y tế thế giới).
: Ung thư phổi.
: National center for biotechnology information (Trung tâm quốc
■
gia về thông tin kỹ thuật sinh học).
OD : Optical density (độ hấp thụ quang).
OR : Odds ratio (tỷ suất chênh).
CEA : Carcinoembryonic antigen.
Cyfra 21-1 : Cytokeratin 19 fragments.
NSE : Neuro specific enolase.
Aa : Acid amin.
: Dalton.
: Amplification refactory mutation system.
: Single strand comformation polymorphyism.
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Biểu đồ so sánh tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong theo giới của UTP ở một số vùng trên thế giới năm 2012 4
Hình1.2. Vị trí của gen CYP1A1 9
Hình 1.3. Cấu trúc của protein CYP1A1 10
Hình 1.4. Chu trình phản ứng của cytochrome P450 1 1
Hình 1.5. Cơ chế tác dụng của CYP1A1 [16] 12
Hình 1.6. Hình ảnh minh họa hiện tượng SNP 13
Hình 1.7. Một số SNP phổ biến của gen CYP1A1 14
Hình 1.8. Các giai đoạn trong phản ứng PCR 15
Hình 1.9. Các kiểu cắt của enzym giới hạn 17
Hình 1.10. Nguyên lý của kỹ thuật giải trình tự gen 18
Hình 2.1. Mô tả kết quả của phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn BsrDI 27
Hình 3.1. Kết quả đo OD của mẫu C94 bằng máy NanoDrop 1000 30
Hình 3.2. Kết quả điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,8% 31
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1.5% 32
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng cắt enzym trên gel agarose 3%… 33
Hình 3.5. Hình ảnh kết quả giải trình tự của mẫu KK20 34
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các SNP thường gặp của gen CYP1A1 14
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR 25
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn 26
Bảng 3.1. Độ tinh sạch và nồng độ DNA tách chiết từ máu ngoại vi của nhóm đối chứng 28
Bảng 3.2. Độ tinh sạch và nồng độ DNA tách chiết từ máu ngoại vi của nhóm ung thư phổi 29
Bảng 3.3. Kiểu gen của nhóm đối chứng và nhóm ung thư phổi 35