PHÁT HIỆN ĐẢO ĐOẠN INTRON 22 CỦA GEN YẾU TỐ VIII BỆNH

HEMOPHILIA BẰNG KỸ THUẬT LONG – RANGE PCR

DETECTION OF INTRON 22 INVERSION OF FACTOR VIII GENE IN

HEMOPHILIA BY LONG – RANGE PCR

 

NGUYÊN LÝ

Hemophilia A là một bệnh rối loạn đông máu , nguyên nhân là do các đột biến trên gen mã hóa yếu tố VIKhoảng 50% người bệnh hemophilia A thể nặng là do đảo đoạn intron 22 của gen yếu tốVIĐảo đoạn này xuất hiện do sự tái tổ hợp giữa vùng 5’ của gen yếu tố VIII (int22h1) với vùng lặp lại (vùng tương đồng) ở phần cuối cùng trên cánh dài của NST X (int22h2 (proximal) hoặc int22h3 (distal)). Kỹ thuật Longrange PCR với sự kết hợp của hai loại enzym: enzym đọc sửa và enzym có hoạt tính tổng hợp đoạn ADN lớn cho phép khuếch đại các vùng ADN tái tổ hợp này tạo ra sản phẩm PCR có kích thước 1012kb. Sản phẩm PCR này được phát hiện khi điện di trên agarose và đọc trên hệ thống đọc gel.

CHỈ ĐỊNH

Xét nghiệm này chỉ định cho tất cả các người bệnh mắc bệnh Hemophilia A thể nặng.

CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo

Phương tiện – Hóa chất

Phương tiện

Máy PCR;

Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp ảnh;

Buồng vô trùng (biology cabinet);

Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);

Máy vortex;

Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;

Đầu côn có màng lọc;

Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;

Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;

Tủ lạnh 4 – 8^oC, tủ âm sâu – 20^oC;

Găng tay.

Hóa chất

Sử dụng kit tách ADN thương mại. Nếu tách thủ công thì sử dụng các sinh phẩm cần thiết để tách chiết ADN như proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.

Hóa chất chạy Longrange PCR gồm: Kit LongRange PCR, MgCl₂, dNTPs, 7 – deaza – dGTP, DMSO, enzym kéo dài chuỗi, nước khử ion vô trùng, các cặp mồi đặc hiệu, theo bảng sau:

P	5’GCCCTGCCTGTCCATTACACTGATGACATTATGCTGAC3’(38 – mer)
Q	5’GGCCCTACAACCATTCTGCCTTTCACTTTCAGTGCAATA 3’(3 – mer)
A	5’CACAAGGGGGAAGAGTGTGAGGGTGTGGGATAAGAA 3’ (36 – mer)
B	5’CCCCAAACTATAACCAGCACCTTGAACTTCCCCTCTCATA3’(40mer)

Hóa chất điện di: thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN, thuốc nhuộm ethidium bromide.

Bệnh phẩm

2 ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA.

Phiếu xét nghiệm

Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu xét nghiệm.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Lấy bệnh phẩm

2 ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA.

Tiến hành kỹ thuật

Bước 1: Tách chiết ADN

Xem bài “Tách chiết ADN từ máu ngoại vi”.

Bước 2: Thực hiện phản ứng Long – range PCR    

Ghi tên các ống phản ứng.

Pha 2 master mix PCR trong box vô trùng tại phòng tiền PCR theo bảng sau:

+ Master mix1 (MM1):

Thành phần	Thể tích
dATP(10mM)	1,25μl
dCTP(10mM)	1,25μl
dTTP (10mM)	1,25μl
dGTP (10mM)	0,625μl
7 – deaza – dGTP (10mM)	0,625μl
Oligo – P (10pmoles/)	0,5μl
Oligo – Q (10pmoles/)	0,5μl
Oligo – A (10pmoles/)	0,2μl
Oligo – B (10pmoles/)	0,2μl
10X buffer	2,0μl
DMSO	0,4μl

+ Master mix 2 (MM2)

Longrange PCR enzym mix (5UI/ μl)	0,5μl
10X longrange PCR buffer	0,5μl
Nước cất	4,0μl

Trộn đều các ống master mix, ly tâm nhẹ để dung dịch xuống đáy ống hoàn toàn;

Chia 8.8μl MM1 vào các ống PCR 0.2ml đã chuẩn bị;

Bổ sung 10 – 20ng ADN mẫu và chứng cùng với nước khử ion vô trùng cho đủ thể tích ống phản ứng là 20μl;

Chạy PCR: Đặt ống phản ứng vào máy PCR, ấn start đợi khi máy đã chạy xong chu kỳ biến tính lần đầu ở 95^οC/30s. Ấn “Pause”;

Mở nắp ống phản ứng, bổ sung 5μl MM2 vào mỗi tube và trộn đều bằng pipet. Ấn “Resume”.

Bước 3: Điện di kiểm tra sản phẩm Longrange PCR

Chuẩn bị gel agarose;

Cân 0.5 g agarose cho vào bình thủy tinh chịu nhiệt;

Thêm 100 ml đệm điện di (TAE 1X /TBE 1X…) vào bình, lắc đều;

Đun mỗi lần 1 phút trong lò vi sóng đến khi agarose tan hoàn toàn;

Để ấm đến 60^o rồi đổ vào khay đã cắm lược;

Để nhiệt độ phòng 30 phút để thạch đông rồi mới rút lược ra.

Điện di:

Lấy 5 µl sản phẩm PCR + 1 µl đệm tra mẫu + 4 µl dH₂0;

Trộn đều và nhỏ vào các giếng theo thứ tự;

Nhỏ 3 µl marker ADN vào giếng kế tiếp;

Đặt bản gel vào máy điện di;

Đổ đệm điện di ngập bản gel và chạy ở hiệu điện thế 90volt/1giờ, kiểm tra băng, nếu có chạy tiếp ít nhất 12 giờ (có thể chạy tới 21 giờ). Nếu không thấy có băng dừng chạy làm lại phản ứng PCR;

Nhuộm bản gel với dung dịch ethidium bromide trong 5 phút; – Chụp ảnh gel, in ảnh và dán vào worksheet.           

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Trên hình ảnh điện di:

Mẫu không có đảo đoạn sẽ có 02 băng ADN: 10kb, 12kb;

Mẫu nam có đảo đoạn sẽ có 02 băng ADN: 10kb,11kb;

Mẫu nữ có đảo đoạn dị hợp tử có 03 băng ADN: 10kb,11kb,12kb.

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

SAI SÓT	XỬ TRÍ
Lấy mẫu không đủ hoặc sai chất chống đông.	Thực hiện theo đúng hướng dẫn qui cách lấy mẫu.
Thao tác pipet không chính xác.	Sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định.
Tín hiệu phản ứng không rõ ràng.	Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất Thực hiện đúng, đủ các bước trong quy trình xét nghiệm.

 

TÀI LIỆU THAM KHẢO

D J Bowen. Haemophilia A and Haemophilia B: molecular insights. J Clin Pathol: Mol Pathol 2002; 55: 1 – 8.

Keeney S et al. The molecular analysis of haemophilia A: a guideline from the UK Haemophilia Centre Doctors’ Organization Haemophilia GeneticsLaboratory Network. Haemophilia 2005; 11: 387 – 97.