Phát hiện đột biến làm thay đổi quá trình hoàn thiện mrna của gen Dystrophin

Loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) và Becker (BMD) là bệnh di truyền lặn liên kết với giới tính, đây là một nhóm bệnh di truyền khá phổ biến chiếm tỉ lệ  1/3500 trẻ  trai. DMD là  thể  bệnh nặng, bệnh nhân thường khởi phát bệnh sớm, yếu cơ có tính chất tiến triển, mất khả năng đi lại lúc 10 – 13 tuổi và chết sớm ở lứa tuổi ngoài 20 do tổn thương cơ tim và  rối loạn  hô  hấp. Trái  lại với DMD, BMD là thể bệnh nhẹ hơn, bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng muộn tiến triển chậm, có cuộc sống kéo dài hơn [1]. Cả DMD và BMD đều gây nên bởi đột biến gen dystrophin, đây là một gen nằm ở vị trí Xp21, có chiều dài khoảng 3000 kb, mã hóa 14kb mRNA là hợp phần của 79 exon. Protein mã hóa bởi gen này có tên là dystrophin, nằm ở màng bào tương của tế bào cơ, có chức năng rất quan trọng trong việc duy trì sự ổn định màng và bảo vệ tế bào cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ [2]. Về mặt di truyền thì DMD khác biệt với BMD bởi 2 kiểu đột biến khác nhau trên gen dystrophin. Đột biến xóa đoạn gây nên DMD thường tạo ra mã kết thúc sớm, kết quả là tổng hợp nên một protein ở dạng bị cắt cụt hoàn toàn và mất chức năng. Trong khi đó với BMD, cho dù bị cắt đoạn, gen đột biến vẫn duy trì được khung dịch mã, protein vẫn được sản xuất ở dạng bán phần và còn chức năng [1]. Đột biến xoá đoạn chiếm khoảng trên 60%. Một số đột biến ít gặp hơn là đột biến điểm, đột biến lặp đoạn hoặc những đột biến xảy ra trong quá trình hoàn thiện mRNA [3]. Quá trình hoàn thiện mRNA đòi hỏi một số trình tự quan trọng nằm ở đầu 5 tận (aceptor splicing site), 3 tận (donor splicing site) và vị trí nhánh của intron (branch point). Ngoài ra quá trình này còn cần một số trình tự khác nằm trong  exon  bao  gồm  vùng  giàu  base  purine (purine – rich region), vùng tăng cường quá trình ghép nối (splicing enhancer sequence – SES) và vùng trình tự nhận biết exon (exon recognition sequence). Khi đột biến một trong những vùng trên sẽ ảnh hưởng đến quá trình hoàn thiện mRNA. Trong nghiên cứu này, chúng tôi báo cáo một đột biến điểm làm lệch khung dịch mã (nonsense mu- tation)  ảnh  hưởng  đến  quá  trình  hoàn  thiện mRNA, đột biến này đã  gây xoá đoạn toàn bộ exon 17. Ở Việt Nam việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh DMD/ BMD vẫn còn nhiều hạn chế, hầu hết các nghiên cứu mới chỉ dừng ở việc xác  định 19 exon nằm trong 2 vùng đột biến phổ  biến [4]. Nghiên cứu này nhằm mục tiêu:
Xác định đột biến xảy ra trong quá trình hoàn thiện mRNA ở bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng là loạn dưỡng cơ duchenne.
I.    ĐỐI  TƯỢNG  VÀ  PHƯƠNG   PHÁP NGHIÊN CỨU
1.    Đối tượng nghiên cứu
Bệnh nhân được chẩn đoán là DMD lúc 2 tuổi, chẩn đoán này dựa vào nồng độ CK tăng cao trong máu và hình ảnh điển hình của sinh thiết cơ, trước đó bệnh nhân có biểu hiện yếu cơ có  tính chất tiến triển với triệu trứng khó đi lại và đi lại hay bị ngã. Bệnh nhân đã mất khả năng đi lại hoàn toàn và phải dùng xe lăn lúc 9 tuổi.
2.    Phương pháp nghiên cứu
    Phân tích đột biến gen ở mức độ  DNA (genome)
DNA được tách triết từ máu ngoại biên theo qui trình phenol/chloroform chuẩn. Để xác định đột biến xóa đoạn, phản ứng polymerase chain reaction (PCR) đã  được  thực  hiện  để  phân tích 19 exon thuộc hai vùng đột biến xoá đoạn trọng điểm ở đầu 5 và  vùng trung tâm của gen dystrophin: exon 1 (hay vùng promoter), 3, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 51, 52, và exon 60. Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 20 μl gồm 1 x Ex – Taq buffer; 2,5 nM dNTPs, 10 pmol mồi xuôi  và  ngược;  1 unit Ex Taq Polymerase (Takara Bio Inc, Kyoto, Japan), 150 ng DNA. Chu kỳ  của phản ứng PCR như sau: 940C – 5 phút [940C – 30 giây, 580C – 30 giây, 720C – 30 giây] trong 35 chu kỳ; 720C – 5 phút; bảo quản ở 40C.
    Phân tích đột biến ở mức độ mRNA RNA tổng số được tách triết từ máu ngoại biên và tổng hợp cDNA theo phương pháp của Chomczynsky [3]. Để xác định đột biến ở mức độ mRNA, phản ứng nested PCR đã được ứng dụng sử dụng 15 cặp mồi để khuyếch đại toàn bộ chiều dài gen dystrophin. Quy trình của phản ứng PCR được sử dụng theo phương pháp của GS. Matsuo và cộng sự [7].
    Xác định trình tự gen
Hai vạch của sản phẩm PCR đã được tinh chế từ gel agarose sau khi chạy điện di, sau đó được chuyển vào Vector tạo dòng PT7 blue. Trình tự nucleotide trên gen được xác định bằng máy đọc trình tự tự động (Model 373A, Applied Biosystems, Foster City, Clifornia, USA).