Phát hiện đột biến mất đoạn Exon 46 và 51 gen Dystrophin ở một số bệnh nhân DMD bằng kỹ thuật PCR

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular dystrophy (DMD)) là bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể X. Đây là bệnh di truyền có tần suất cao nhất trong các bệnh cơ di truyền gặp ở trẻ em, bệnh gặp chủ yếu ở trẻ trai (1/3500 trẻ trai). Nguyên nhân của bệnh là do đột biến gen dystrophin dẫn tới không tổng hợp được dystro- phin một protein tham gia vào cấu tạo màng tế bào cơ, gây huỷ hoại tế bào cơ và biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng của trẻ [1].
Bệnh DMD thường khởi phát từ  3 đến 5 tuổi với biểu hiện đi lại hay vấp ngã, yếu cơ, teo cơ, tiến triển nặng dần dẫn tới mất khả năng đi lại vào khoảng 12 → 15 tuổi và chết ở lứa tuổi 18 → 25 vì tổn thương cơ tim và suy hô hấp [1].
Gen dystrophin nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể giới X (vị trí Xp2.1), chiều dài 3000 kb và là gen lớn nhất của người với  79 exon tổng hợp nên protein  tương  ứng là  dystrophin có  mặt  ở màng tế bào cơ. Tổn thương gen dystrophin thường gặp nhất là mất đoạn gen chiếm tỷ lệ 65% trong tổng số các loại đột biến. Đột biến mất đoạn gen dystrophin thường tập  trung ở 2 vùng hay xẩy ra mất đoạn của gen còn gọi là “hot spots”: vùng thứ nhất từ exon 2 – 20, vùng thứ hai từ exon 43 – 60. Các đột biến khác hiếm gặp hơn như nhân đoạn, đột biến điểm, thêm đoạn, chuyển đoạn [1, 4, 5]. Các nước đã nghiên cứu về bệnh DMD thường khảo sát những exon trong vùng hay xẩy ra mất đoạn gen ở những bệnh nhân DMD, để tìm ra exon nào thường xảy ra mất đoạn cho chủng tộc của mình, hơn nữa nghiên cứu phát hiện mất đoạn gen tiến hành trên những bệnh nhân DMD sẽ là cơ sở để phục vụ chẩn đoán trước sinh cho các đối tượng có nguy cơ liên quan đến bệnh nhân DMD như mẹ bệnh nhân, chị em gái của bệnh nhân khi xây dựng gia đình hoặc muốn sinh con tiếp theo [4,  6].  Trong  nghiên  cứu  trước,  chúng  tôi  đã nghiên cứu phát hiện đột biến gen ở exon 12 và 48 ở một số bệnh nhân DMD và đã phát hiện Tỷ lệ đột biến mất đoạn gen của exon 12 là 9,5% và exon  48  là  52,4%  [3].  Trong  nghiên  cứu  này
1.    Đối tượng
–    Nhóm  chứng:  Gồm  10  người  nam  bình thường, tiền sử không có ai mắc bệnh di truyền.
–    Nhóm bệnh: 58 bệnh nhân nam đã  được chẩn đoán xác định là DMD dựa trên lâm sàng và xét nghiệm đo hoạt độ enzym creatine kinase và tiền sử di truyền
2.    Phương pháp
–    Mỗi người nam bình thường và  mỗi  bệnh nhân được lấy 2 ml máu chống đông EDTA. Các mẫu máu được chiết tách toàn  bộ  ADN tổng số theo phương pháp perchlorate  sodium dùng đệm ly giải hồng cầu, bạch cầu và xử lý với proteinase K.    ADN của mỗi người nam bình thường và  mỗi bệnh nhân DMD được kiểm tra độ tinh sạch bằng đo tỉ số  mật độ quang  OD260nm/OD280nm và điện di kiểm tra ADN.
–    Hai cặp mồi cho exon 46 và 51 được áp dụng với trình tự theo Chamberlain và cộng sự và Beggs và cộng sự được đặt mua theo hãng của Mỹ. Thực hiện phản ứng PCR dựa theo kit tiêu  chuẩn của hãng có điều chỉnh và dò nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho cả 2 cặp mồi.
–    Phản ứng PCR được thực hiện trong thể tích 50μl với các thành phần chính: Buffer taq,  200 μm dNTP, 1,5μM MgCl2; 2,5 unit Taq DNA poly- merase, 250ng ADN mẫu, primer 0,5μm mỗi loại, nước vừa đủ 50μl.
–    Phản ứng PCR được thực hiện theo  chương trình: khởi đầu là 940C /3 phút, tiếp theo là 35 chu chúng tôi chỉ tập trung vào 2 exon 46 và 51 thuộc vùng thứ hai hay xảy ra mất đoạn của gen dystro- phin trong khoảng từ exon 43 – 60. Mục tiêu:
1.    Hoàn chỉnh kỹ thuật PCR với 2 cặp  mồi của exon 46 và 51, áp dụng trên nhóm chứng và nhóm bệnh nhân DMD.
2.    Phát hiện đột biến mất đoạn exon 46  và 51 ở một số bệnh nhân DMD.
I.    ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG    PHÁP NGHIÊN CỨU
kỳ: 94 C /45 giây, 53 C/30 giây, 72 C/1 phút 30 giây và cuối cùng là  720C kéo dài 10 phút. Sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel agarose 2% và nhuộm ethidium bromid 0,5 mg/ml. Mỗi phản ứng đều có đối chứng dương (ADN của người nam bình thường) và đối chứng âm (mẫu được thay bằng nước cất) kèm theo.
–    Đọc kết quả dưới đèn tử  ngoại UV, kết  quả điện di sản phẩm PCR của các mẫu được đọc so với Marker thang chuẩn 100bp. Do hai  cặp mồi được thiết kế đặc hiệu cho exon 46 và exon 51 nên ở người nam bình thường trên hình ảnh điện di sẽ xuất hiện 2 băng đặc hiệu 148bp cho exon 46 và 388 bp cho exon 51. Ở bệnh nhân DMD đột biến mất đoạn exon nào sẽ không có băng đặc hiệu cho exon đó, vì khi bị đột biến mất đoạn ADN của exon đó  sẽ  không  có  vị trí bổ  trợ  để  mồi gắn  vào nên không có sản phẩm PCR của băng đó

DMD là bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể X, do đột biến gen dystrophin gây nên: đột biến mất đoạn là phổ biến nhất, nó thường tập trung ở một số exon. Mục tiêu: (1). Hoàn chỉnh kỹ thuật PCR với 2 cặp mồi của exon 46 và 51, áp dụng trên nhóm chứng và nhóm bệnh nhân DMD; (2). Phát hiện đột biến mất đoạn exon 46 và 51 ở một số bệnh nhân DMD. Đối tượng và phương pháp: Sử dụng phương pháp PCR với 2 cặp mồi cho exon 46 và 51 áp dụng cho 10 người nam bình thường và 58 bệnh nhân nam DMD. Kết quả: Nhóm chứng:10 người nam bình thường có mặt cả 2 exon 46 và 51. Nhóm bệnh: Tỷ lệ phát hiện mất đoạn exon 46 và 51 ở 58 bệnh nhân là 23/58 (39,7%. Tỷ lệ phát hiện mất đoạn exon 46,51 và cả hai exon 46 và 51 theo thứ tự là: 15/58 (25,9%); 14/58 (24,1%); 6/58 (10,3%). Kết luận: PCR là phương pháp nhanh, tin cậy nên được áp dụng phát hiện mất đoạn gen ở những bệnh nhân DMD để tư vấn di truyền nhằm mục đích phòng bệnh và đặt cơ sở cho chẩn đoán trước sinh.