Phát hiện đột biến mất đoạn gen Dystrophin và phân bố mất đoạn ở một số bệnh nhân Việt Nam bị loạn dưỡng cơ Duchenne

Loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular dystrophy (DMD)) là bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể X có tần số mắc cao nhất trong các bệnh cơ ở trẻ em. Những đột biến gen dystrophin là nguyên nhân gây ra bệnh [8]. Gen dystrophin nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể X (Xp2. 1) và là gen lớn nhất của người với chiều dài 3000 Kb, chứa 79 exon. Gen này phiên mã ra mARN 14Kb và tổng hợp protein dystrophin tham gia vào cấu trúc và bảo vệ màng tế bào cơ [8]. Những bệnh nhân bị đột biến gen dẫn tới không tổng hợp được dystrophin làm cho màng tế bào cơ bị huỷ hoại khi co cơ, giải phóng creatine kinase (CK) vào máu, hậu quả là gây nên các triệu chứng teo cơ, mất khả năng đi lại và chết trước tuổi trưởng thành vì tổn thương cơ tim và suy hô hấp [4].
Các nhà nghiên cứu trên thế giới đã nghiên cứu đột biến gen cho thấy, đột biến gen bao gồm các dạng: mất đoạn là chủ yếu chiếm 50 – 65%, nhân đoạn từ 2 – 7%, còn lại là đột biến điểm và chuyển đoạn. Các đột biến mất đoạn gen dystrophin thường tập trung vào 2 vùng “hot spots”
còn gọi là điểm nóng hay xảy ra mất đoạn: vùng tận cùng 5 của gen từ exon 1 – 19 và vùng trung tâm của gen từ exon 43 – 60 [1; 2; 8].
Ở Việt Nam, bệnh DMD đã được nghiên cứu về lâm sàng, đặc điểm di truyền, giá trị CK trong chẩn đoán sớm và phát hiện dị hợp tử và bước đầu  đã  nghiên  cứu  phát  hiện  đột  biến  gen. Phương pháp CK cho phép sàng lọc, phát hiện nhanh và khá chính xác bệnh DMD. Tuy nhiên phương pháp này không thể phát hiện đột biến gen và chẩn đoán trước sinh. Đối với những bệnh di  truyền  tiên  lượng  nặng  như  bệnh  DMD  xu hướng chung của Thế giới là phát hiện đột biến gen ở bệnh nhân, phát hiện đột biến gen cho những người nữ dị hợp tử liên quan với bệnh nhân (carriers), tư vấn di truyền và áp dụng chẩn đoán trước sinh cho những gia đình với đột biến đã biết [6].
Đột biến mất đoạn là dạng chủ yếu gặp với tỷ lệ cao, hơn nữa các đột biến mất đoạn thường tập trung vào một số exon thuộc 2 vùng “hot spots”. Vì vậy, trong điều kiện Việt Nam cần ưu tiên phát triển kỹ thuật Multiplex PCR với một số cặp mồi để khảo sát các exon trong vùng hay xẩy ra mất đoạn để đỡ tốn kém trong việc phát hiện đột biến mất đoạn gen ở bệnh nhân DMD. Xuất phát từ thực tế trên đề tài này nhằm mục tiêu:
Xác định tỷ lệ đột biến mất đoạn gen dystrophin và tìm hiểu phân bố đột biến mất đoạn exon ở những bệnh nhân Việt Nam bị DMD.
I.    ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG    PHÁP NGHIÊN CỨU
1.    Đối tượng nghiên cứu
–    Người nam bình thường: gồm 2 người với tiền sử gia đình không có ai bị bệnh DMD được dùng làm chứng dương (+).
–    Nhóm bệnh: gồm 62 bệnh nhân nam  được thu thập từ tháng 6/2003 đến tháng 8/2006. Các bệnh nhân này được chẩn đoán xác định là DMD tại khoa Nội tiết – Chuyển hoá – Di truyền, bệnh viện Nhi Trung ương: dựa trên các tiêu chuẩn lâm sàng như Duchenne mô tả và kết quả xét nghiệm CK (tăng từ 20 – 100 lần hoặc hơn nữa so với trị số bình thường) , xét nghiệm điện cơ. Mỗi bệnh nhân được làm bệnh án và hỏi về tiền sử gia đình và xây dựng  phả hệ: các gia đình có tiền sử di truyền  (TSDT) rõ là các gia đình có ≥ 2 con bị bệnh hoặc ≥ 2 thế hệ có người bị bệnh, các gia đình có TSDT không rõ là các gia đình chỉ sinh duy nhất 1 con bị bệnh DMD.
2.    Phương pháp nghiên cứu:
Phương pháp chiết tách ADN và thực hiện phản ứng Multiplex PCR được thực hiện tại Labô Trung tâm Y sinh học, bộ môn Y sinh học – Di truyền Đại học Y Hà Nội và phòng Di truyền Tế bào phân tử bệnh viện Nhi Trung ương.
–    2 người nam bình thường và mỗi bệnh nhân DMD được lấy 2 ml máu chống đông bằng EDTA, các mẫu máu được chiết tách ADN tổng số theo phương pháp Perchlorate sodium hoặc Qiagen kit, sau đó được kiểm tra độ tinh sạch bằng đo tỉ số mật độ quang OD 260nm/OD 280 nm, đo nồng độ ADN và điện di kiểm tra ADN.
–    Kỹ thuật Multiplex PCR với 19 cặp mồi được thiết kế theo Chamberlain và Beggs năm 1990 để tăng lượng 19 exon thường xẩy ra mất đoạn được chia làm 3 tổ hợp phản ứng: tổ hợp A tăng lượng các exon 4, 8, 12, 17, 19, 44, 45, 48, 51; tổ hợp B tăng lượng các exon 3, 6, 13, 43, 47, 50, 52, 60 và vùng promoter cơ (Pm);  tổ  hợp C tăng lượng các exon 43 và 49.
–    Phản  ứng  Multiplex  PCR  được  thực  hiện trong thể tích 25μl với các thành phần chính như sau: Buffer taq, dNTP, MgCl2, 1,25 unit Taq DNA polymerase, 100 ng ADN mẫu,  primer mỗi loại, nước vừa đủ 25μl.
–    Phản ứng PCR được thực hiện theo  chương trình: khởi đầu là 940C /3 phút, tiếp  theo là 35 chu kỳ: 940C /45 giây, 550C/30 giây, 720C/ 1phút 30 giây và cuối cùng là 720C kéo  dài 10 phút. Các tổ hợp khác thì nhiệt độ gắn mồi thay đổi tuỳ từng tổ hợp. Sản phẩm PCR  được chạy điện di trên gel agarose 2,5% và nhuộm ethidium bromid 0,5 mg/ml. Mỗi phản ứng đều có đối chứng dương (ADN của người nam bình thường) và đối chứng âm ( mẫu được thay bằng nước cất) kèm theo.
–    Đọc kết quả dưới đèn tử ngoại UV, kết quả điện di sản phẩm PCR của các mẫu được đọc so với Marker thang chuẩn 100 bp. Ở  người nam bình thường trên hình ảnh điện di  sẽ xuất hiện các băng đặc hiệu tương ứng với sản phẩm PCR của 19 exon. Ở bệnh nhân  DMD đột biến mất đoạn exon nào sẽ không  có băng đặc hiệu cho exon đó.
Loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) là bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể X, được gây nên do đột biến gen dystrophin, đột biến mất đoạn là phổ biến. Mục tiêu: xác định tỷ lệ đột biến mất đoạn gen dystrophin và tìm hiểu phân bố đột biến mất đoạn exon ở những bệnh nhân DMD. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: sử dụng phương pháp multiplex PCR với 19 cặp mồi để tăng lượng 18 exon và vùng promoter của cơ (Pm) cho 62 bệnh nhân nam DMD. Những mất đoạn exon được phát hiện bằng điện di sản phẩm PCR. Kết quả và kết luận: đã phát hiện đột biến mất đoạn ở 32 trong tổng số 62 bệnh nhân (51,6%). Tỷ lệ đột biến ở nhóm bệnh nhân DMD có TSDT rõ và không rõ là tương đương nhau theo thứ tự 52,9%; 51,1%. Phân bố đột biến mất đoạn ở vùng trung tâm của gen từ exon 44 – 52 là chủ yếu chiếm tỷ lệ 89,3%; vùng tận cùng 5( exon 3 – 19 và vùng promoter cơ) hiếm gặp hơn (10,7%).