PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN GEN GÂY BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE VÀ BECKER BẰNG KỸ THUẬT MLPA
PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN GEN GÂY BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE VÀ BECKER BẰNG KỸ THUẬT MLPA
Nguyễn Khắc Hân Hoan*, Quách Thị Hoàng Oanh*, Phạm Ngọc Khôi**, Nguyễn Thị Phương Mai***,
Ngô Diễm Ngọc***, Trần Vân Khánh****
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) và bệnh loạn dưỡng cơ Becker (BMD) là bệnh di truyền thần kinh cơ phổ biên nhất, với xuất độ khoảng 1/3.500 trẻ trai sinh sống(7). Bệnh do đột biên gen dystrophin (gen DMD) gây ra. Đây là gen lớn nhất ở người nằm dài 2400kb ở vị trí Xp21.2, gồm 79 exon mã hóa 14 kb mRNA(1’8’15). Thông tin chi tiết về gen được phổ biên tại www.dmd.nl.
Bệnh nhân DMD thường bị nhược cơ xuất hiện sớm từ 2 – 3 tuổi, tiên triển nhanh, mất khả năng đi lại và chêt ở lứa tuổi 20 do vì tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp. Bệnh nhân BMD biểu hiện bệnh nhẹ hơn, tiên triển chậm và có cuộc sống kéo dài. Tuy nhiên chất lượng cuộc sống thường kém(7).
Hơn 65% trường hợp bệnh DMD và BMD là do đột biên mất đoạn gen hoặc lập đoạn gen dystrophin gây ra(21017). Các loại đột biên khác gồm có mất vài nucleotid, đột biên điểm và chuyển đoạn. Hầu hết các đột biên mất đoạn tập trung chủ yêu ở hai vùng nóng (hot spot) ở đầu 5′ (exon 3-20) và vùng trung tâm (exon 44-55)(3>4>7). Tuy nhiên không có sự tương quan giữa kích thước của đoạn gen bị mất với mức độ biểu hiện bệnh.
Phát hiện đột biên gen gây bệnh có ý nghĩa rất lớn nêu áp dụng vào giai đoạn trước sinh. Trước đây kỹ thuật thường được sử dụng là Southern blot. Tuy nhiên đây là kỹ thuật đòi hỏi tốn rất nhiều công và thời gian. Để thể phát hiện 79 exon phải lai các hỗn hợp probe 7 – 8 lần. Về sau kỹ thuật multiplex PCR được Chamberlain phát triển thành phương tiện chẩn đoán nhanh hơn(2). Kỹ thuật realtime PCR gần đây cũng được phát triển, tuy nhiên còn nhiều hạn chê(11). Tại Việt Nam, phát hiện các đột biên mất đoạn thường được dựa vào kỹ thuật đơn PCR(1213) hoặc kỹ thuật multiplex PCR(14).
Gần đây, kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) ra đời
genetic disorder, mutation, exon, PCR, MLPA. với khả năng khuêch đại cùng lúc đên 45 vị trí DNA đích khác nhau trong một phản ứng(1819). Mỗi probe MLPA gồm 2 đoạn oligonucleotide lai với trình tự DNA đích tại vị trí liền kề với nhau, dài 22-43 nucleotide và một PCR primer xuôi hoặc ngược giống nhau ở tất cả các probe. Để phân biệt sản phẩm khuyêch đại, các probe còn chứa một đoạn DNA gắn chèn không tham gia vào lai có kích thước thay đổi (19-364 nt). Sau khi lai qua đêm với trình tự DNA đích, 2 đoạn oligonucleotide của mỗi probe sẽ nối ghép (ligation) với nhau. Sản phẩm nối có cả primer xuôi và ngược và được khuêch đại bằng PCR. Số” lượng tương đối của mỗi sản phẩm PCR sẽ tỉ lệ với số” bản sao của trình tự đích trong mẫu khảo sát. Kích thước khác nhau của các sản phẩm sẽ được nhận biêt bằng hệ thống giải trình mao quản tự động và đỉnh của mỗi sản phẩm sẽ được đinh lượng(1819).
Kỹ thuật đã được ứng dụng vào chẩn đoán đột biên mất đoạn gây DMD/BMD rất hiệu quả(18). Tuy nhiên đến nay Việt Nam vân chưa có nghiên cứu nào về kỹ thuật này. Vì thê, chúng tôi thực hiện thử nghiệm xác định đột biên mất đoạn gen DMD bằng kỹ thuật MLPA
Hy vọng sẽ giúp ích cho các bạn, cũng như mở ra con đường nghiên cứu, tiếp cận được luồng thông tin hữu ích và chính xác nhất