PHÁT HIỆN GEN JAK2 V617F BẰNG KỸ THUẬT AS – PCR

DETECTION OF JAK2 V617F GENE MUTATION BY AS – PCR

 

NGUYÊN LÝ

Phát hiện đột biến JAK2 V617F (Janus Kinase Valin 617 Phenylalamin) trong các mẫu bệnh phẩm của người mắc hội chứng tăng sinh tủy mạn để góp phần chẩn đoán, xếp loại các bệnh đa hồng cầu nguyên phát, tăng tiểu cầu tiên phát, xơ tủy nguyên phát phục vụ cho điều trị bệnh.

Đột biến JAK2 V617F được phát hiện bằng kỹ thuật Allen – specific PCR (AS – PCR). Trong Allen – specific PCR (AS – PCR) người ta thiết kế một đoạn primer có trình tự sai khác so với trình tự đặc hiệu một nucleotide ở đầu 3’ để ngăn cản quá trình kéo dài chuỗi ADN của enzym Taq – polymeraza trong phản ứng PCR. Trong phương pháp này, người ta thiết kế hai ống phản PCR song song: ống phản thứ nhất sử dụng cặp primer đặc hiệu cho allen bình thường, ống phản ứng thứ hai sử dụng cặp primer để nhân bản allen đột biến. Phản ứng ASPCR luôn có ít nhất một sản phẩm: nếu người bệnh dị hợp tử thì trong hai ống phản ứng PCR đều có một băng sản phẩm đặc hiệu, nếu người bệnh đồng hợp tử mang gen bệnh thì chỉ có ống phản ứng 2 có băng đặc hiệu, còn người bệnh đồng hợp tử bình thường thì chỉ ống phản ứng 1 có băng sản phẩm đặc hiệu.

CHỈ ĐỊNH

Xét nghiệm này được chỉ định cho tất cả các người bệnh thuộc hội chứng tăng sinh tủy mạn.

CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo.

Phương tiện – Hóa chất

Phương tiện

Máy PCR

Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp ảnh.

Buồng vô trùng (biology cabinet).

Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút).

Máy vortex.

Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl.

Đầu côn có màng lọc.

Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza.

Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza.

Tủ lạnh 4 – 8⁰C, tủ âm sâu – 20^oC.

Găng tay.

Hóa chất

Sử dụng kit tách ADN thương mại. Nếu tách thủ công thì sử dụng các sinh phẩm cần thiết để tách chiết ADN như proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.

Hóa chất chạy PCR gồm: Đệm, MgCl₂, dNTPs, enzym kéo dài chuỗi, nước khử ion vô trùng, các cặp mồi đặc hiệu.

Hóa chất điện di: thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN, thuốc nhuộm ethidium bromide.

Bệnh phẩm

2 ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA.

Phiếu xét nghiệm

Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu xét nghiệm.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Lấy bệnh phẩm

2 ml máu toàn phần đựng trong ống chống đông EDTA.

Tiến hành kỹ thuật

Bước 1: Tách chiết ADN

Xem bài “Tách chiết ADN từ máu ngoại vi”.

Bước 2: Thực hiện phản ứng AS – PCR

Đưa các thành phần cần thiết của phản ứng ra nhiệt độ phòng 10 phút để rã đông hoàn toàn.

Trộn lẫn các thành phần sau vào một ống 0,2 ml:

Sinh phẩm	Số lượng (µl)
Buffer 10X	2,5
dNTPs (500µM)	2
MgCl2 (25mM)	2
Primer F(bình thường/đột biến)	1
Primer R(bình thường/đột biến)	1
Enzym Taq	0,5
Nuclease free H2O	25 – x
ADN khuôn (100 ng)	X
Tổng thể tích	25

(x: thể tích ADN đạt nồng độ 100 ng)

Ly tâm nhẹ để các thành phần lắng xuống đáy ống hoàn toàn

Đặt vào máy PCR – Chọn chương trình

Bấm start để máy chạy.

Bước 3: Điện di sản phẩm PCR Chuẩn bị gel agarose:

Cân 1 g agarose cho vào bình thủy tinh chịu nhiệt.

Thêm 100 ml đệm điện di (TAE 1X /TBE 1X…) vào bình, lắc đều.

Đun mỗi lần 1 phút trong lò vi sóng đến khi agarose tan hoàn toàn.

Để ấm đến 60⁰ rồi đổ vào khay đã cắm lược.

Để nhiệt độ phòng 30 phút để thạch đông rồi mới rút lược ra.

Điện di:

Lấy 5 µl sản phẩm PCR + 1 µl đệm tra mẫu 6X + 4 µl dH₂0

Trộn đều và nhỏ vào các giếng theo thứ tự

Nhỏ 3 µl marker ADN vào giếng kế tiếp

Đặt bản gel vào máy điện di

Đổ đệm điện di ngập bản gel và chạy ở 100 V trong 20 phút

Nhuộm bản gel với dung dịch ethidium bromide trong 5 phút

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Kết quả dương tính nếu nhìn thấy vạch sáng dưới đèn UV, sản phẩm có kích thước phù hợp theo lý thuyết.

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

SAI SÓT	XỬ TRÍ
Lấy mẫu không đủ hoặc sai chất chống đông.	Thực hiện theo đúng hướng dẫn qui cách lấy mẫu.
Thao tác pipet không chính xác.	Sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định.
Tín hiệu phản ứng không rõ ràng.	Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất Thực hiện đúng, đủ các bước trong quy trình xét nghiệm.

 

TÀI LIỆU THAM KHẢO

A.Rolfs et at (1992). PCR: Clinical Diagnosis and Research. Springer Verlag, Berlin.

Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ et at. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet 2005; 365: 1054 – 61.