Phát hiện khuyết đoạn gen ở nhũng bệnh nhân loạn dưỡng cơ duchenne bằng phương pháp multiplex pcr

Loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy(DMD)) là bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể X và là bệnh di truyền phổ biến có tần số cao nhất trong các bệnh cơ di truyền. Tiên lượng của bệnh nặng, có thể dẫn đến tàn phế mất khả năng đi lại vào lúc 12-15 tuổi và chết ờ lứa tuổi 18- 20 vì tổn thương cơ tim và suy hô hấp [156].

Bệnh gây nên do di truyền hoặc đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử ở bố hoặc mẹ. Vì vậy bệnh liên tục xẩy ra ở Việt Nam cũng như các nước trên thế giới.

Nguyên nhân của bệnh là do đột biến gen dystrophin dẫn tới không tổng hợp được dystrophin, protein này tham gia vào cấu trúc và chức năng bảo vệ màng tế bào cơ, trong bệnh DMD vắng mặt hoàn toàn sản phẩm dystrophin làm màng tế bào cơ bị huỷ hoại giải phóng enzym đặc hiệu của cơ là creatine kinase(CK) vào máu và biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng của trẻ[59].

Gen dystrophin nằm trên nhiễm sắc thể X, nhánh ngắn vùng 2 băng l(Xp2.1), chiều dài 3000 Kb, chứa 79 exon với ít nhất 8 promotor đặc hiệu mô và là gen lớn nhất của người được biết cho tới nay. Gen này mã hoá ra mARN 14 Kb và tổng hợp sản phẩm protein tương ứng là dystrophin có mặt ở màng tế bàocơ[74] [120].

Tổn thương đột biến gen dystrophin có thể rải rác khắp 79 exon và vùng promotor của gen, nhiều nước đã nghiên cứu về đột biến gen bệnh DMD cho thấy mất đoạn gen là dạng đột biến phổ biến nhất chiếm tỉ lệ 50-70% và nhân đoạn chiếm tỉ lệ 2-7%, còn lại là những đột biến điểm, thêm đoạn, chuyển đoạn [27][29] [32] [38] [50] [53] [61] [63] [64].

Ở Việt nam, bệnh DMD đã được nghiên cứu về lâm sàng và giá trị của phương pháp đo hoạt độ creatine kinase(CK) trong chẩn đoán sớm và phát hiện nữ dị hợp tử để tư vấn di truyền [7] [8] [11] [12]. Phương pháp CK cho phép sàng lọc chẩn đoán nhanh, khá chính xác bệnh DMD nhưng không thể phát hiện đột biến gen bệnh và ứng dụng chẩn đoán trước sinh.

Đối với những bệnh di truyền tiên lượng nặng như bệnh DMD xu hướng chung của thế giới là phát hiện đột biến gen ở bệnh nhân, phát hiện những người nữ dị hợp tử, tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh nhằm mục đích phòng bệnh.

Mất đoạn gen là dạng đột biến phổ cập nhất, để tiết kiệm thời gian và đỡ tốn kém dò tìm 79 exon, *các nước thường sử dụng phương pháp Multiplex PCR để khảo sát 18 exon, tập trung vào 2 vùng “ hot spots” hay xẩy ra mất đoạn của gen dystrophin.

Trong điều kiện Việt Nam, thật cần thiết ưu tiên phát triển kỹ thuật Multiplex PCR phát hiện đột biến mất đoạn gen, để biết đột biến mất đoạn hay xẩy ra ở những exon nào, từ đó lựa chọn những cặp mồi nào phù hợp để tăng khả năng phát hiện đột biến mất đoạn gen, giúp cho tư vấn di truyền và đặt cơ sở cho chẩn đoán trước sinh ở những gia đình với những đột biến đã biết.

Xuất phát từ thực tế trên đề tài này nhằm 2 mục tiêu:

1. Sử dụng phương pháp Multiplex PCR với 19 cặp mồi để phát hiện khuyết đoạn gen dystrophin ở bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne.

2. Bước đầu tìm hiểu xem exon nào của gen dystrophin thường xảy ra mất

đoạn gen.

MỤC LỤC

ĐẬT VẤN ĐỂ 1

Chương 1: TổNG QUAN

1.1. Đặc điểm di truyền của bệnh DMD 3

1.2. Tần số của bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne 5

1.3. Cơ sở di truyền phân tử của bệnh DMD > 5

1.3.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen DMD 5

1.3.2. Cấu trúc và chức năng của Dystrophin 8

1.4. Cơ chế bệnh sinh của DMD 9

1.5. Cơ chế di truyền của bệnh DMD 10

1.5.1. Gen đột biến có sẵn trên NSTX của mẹ 10

1.5.2. Đột biến mới 10

1.5.3. Dạng khảm Soma tại locus DMD 11

1.5.4. Dạng khảm dòng tế bào mầm trong bệnh DMD 12

1.6. Các dạng đột biến cấu trúc của gen dystrophin 13

1.6.1. Đột biến khuyết đoạn gen DMD 13

1.6.2. Đột biến nhân đoạn trong gen DMD 15

1.6.3. Đột biến điểm xẩy ra trong gen DMD 15

1.6.4. Đột biến kiểu chuyển đoạn gây bệnh DMD ở trẻ gái 16

1.7. Các phương pháp xét nghiệm trong chẩn đoán bệnh DMD 16

1.7.1. Phương pháp đo hoạt độ creatine kinase trong huyết thanh 16

1.7.2. Phương pháp thăm dò điện sinh lý cơ(ghi điện cơ) 18

1.7.3. Phương pháp sinh thiết cơ, chẩn đoán giải phẫu bệnh vi thể 18 trong xác định tổn thương cơ ở bệnh nhân

1.7.4. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang 19

1.7.5. Xét nghiêm ADN 21

1.8. Các phương pháp phát hiện đột biến gen dystrophin 24

1.8.1. Phát hiên những tổn thương lớn của gen dystrophin

2 X

1.8.2. Phát hiện những tổn thương nhỏ của gen dystrophin ở những 24

bệnh nhân

1.8.3. Phát hiện những tổn thương nhỏ ở những người nữ mang gen 26

1.9. Phòng bệnh DMD t 26

1.9.1. Phát hiện những trường hợp DMD 27

1.9.2. Phát hiện đột biến gen ở những bệnh nhân DMD/BMD 27

1.9.3. Phát hiện những người’lành mang gen bệnh DMD(carriers) 28

1.9.4. Cho lời khuyên di truyền 30

1.9.5. Phương pháp chẩn đoán trước sinh và chẩn đoán ADN của 33 phôi trước khi cấy phôi vào cơ thể

1.10. Khả năng điều trị bệnh DMD 35

1.11. Tình hình nghiên cứu bệnh DMD ở trong nước 37

Chương 2: ĐÔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1. Đối tượng nghiên cứu 40

2.1.1. Nhóm chứng 40

2.1.2. Nhóm bệnh 40

2.2. Nơi thưc hiên

• 42

2.3. Phương pháp nghiên cứu 42

2.3.1. Phương pháp thu thập thông tin từ bệnh nhân và gia đình bệnh 42

nhân

2.3.2. Phương pháp xét nghiêm CK toàn phần trong huyết thanh 43

2.3.3. Phương pháp lập và phân tích phả hệ 43

2.3.4. Phương pháp chiết tách ADN từ máu ngoại vi bằng phương 44

pháp perchlorat sodium

2.3.5. Kỹ thuật chiết tách ADN từ máu ngoại vi theo Qiagen kit 47

2.3.6. Phương pháp multiplex PCR 47

2.3.7. Xử lý số liêu theo phương pháp thống kê y sinh hoc

5 2

Chương 3. KẾT QUẢ

3.1. Kiểm tra kết quả chiết tách ADN ở 10 người nam bình thường theo phương pháp perchlorat sodium

3.1.1. Kiểm tra kết quả tinh khiết của ADN

4 53

3.1.2. Đo hàm lượng ADN 53

3.2. Nhóm bệnh nhân DMD 55

3.2.1. Giới của bệnh nhân 55

3.2.2. Tiền sử di truyền trong gia đình 55

3.2.3. Tỉ lệ bệnh nhân DMD có đột biến mất đoạn 56

3.2.4. 35 bệnh nhân được khảo sát thêm exon 46 61

3.2.5. 30 bệnh nhân được khảo sát thêm exon 16, 32, 34, 41, 42, và 61

vùng promotor não(Pb)

3.3. Nhóm mẹ, và chị em gái của mẹ bệnh nhân DMD được xét 62

nghiêm CK cho tư vấn di truyền

3.4. Minh hoạ một số hình ảnh kết quả PCR khảo sát những exon 64

trong vùng hay xẩy ra mất đoạn của gen dystrophin ở bệnh nhân DMD

3.5. Minh hoạ một số phả hệ phối hợp với xét nghiệm CK và phân 74

tích ADN của một số bệnh nhân

3.6. Ảnh minh hoạ bệnh nhân DMD 78

Chương 4 : BÀN LUẬN

4.1. DMD là bệnh phát sinh do cơ chế di truyền và đột biến mới

4.2.S0 sánh các phương pháp di truyền phân tử phát hiện đột biến mât đoạn gen và tình hình phát hiện đột biến mất đoạn gen ở các nước

4.2. 1. So sánh các phương pháp di truyền phân tử phát hiện đột biếnmất đoạn gen

4.2.2. So sánh về nghiên cứu mất đoạn gen ở một số nước trên thế giới

4.3. Những bệnh nhân được chẩn đoán là DMD nhưng chưa phát hiện được đột biến gen

KẾT LUẬN

KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO