Phát hiện một đột biến mới trên exon 15 của gen APC ở một số gia đình mắc bệnh đa polyp tuyến đại trực tràng

Bệnh đa polyp tuyến đại trực tràng (Familial adenomatous polyposis – FAP) gây nên bởi đột biến gen adenomatous polyposis coli (APC), hầu hết các đột biến được phát hiện trên exon 15 của gen này và người bệnh nếu không được điều trị kịp thời sẽ tiến triển thành ung thư trước 40 tuổi. MỤC ĐÍCH: Phát hiện các đột biến trên exon 15 của gen APC ở một số gia đình có người mắc bệnh đa polyp tuyến đại trực tràng. PHƯƠNG PHÁP: 9 gia đình có người mắc FAP được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu. DNA được tách chiết từ máu toàn phần. Phương pháp giải trình tự đã được sử dụng để phát hiện đột biến. KẾT QUẢ: 3 bệnh nhân của 3 gia đình được phát hiện là có một đột biến mới với 4 nucleotid lặp lại ở vị trí 134890 (134890 AGAA) của gen APC. Phân tích gen APC của các thành viên trong 3 gia đình phát hiện thấy, 5/6 bệnh nhân FAP và 7/8 thành viên khỏe mạnh có vị trí đột biến mới này. KẾT LUẬN: Phân tích đột biến gen APC trên các gia đình mắc bệnh đa polyp đại trực tràng là một hướng đi tốt giúp chẩn đoán sớm, theo dõi và điều trị bệnh hiệu quả.
1.    Đặt vấn đề
Sự phát triển polyp đại trực tràng là kết quả của quá trình tăng sinh bất thường tế bào. Bình thường quá trình tăng sinh tế bào chịu sự kiểm soát của hai nhóm gen: nhóm gen gây ung thư và nhóm gen ức chế khối u. Đột biến ở bất kỳ gen nào trong số này đều có thể dẫn đến sự mất kiểm soát quá trình phân chia tế bào làm cho tế bào sẽ phát triển quá mức bình thường. Ở đại tràng và trực tràng sự tăng sinh này tạo thành những khối polyp và gây nên bệnh đa polyp tuyến đại trực tràng (FAP). Tuổi xuất hiện của FAP sớm, khoảng 16 tuổi và sẽ phát triển thành ung thư đại trực tràng trước tuổi 40 nếu không được chẩn đoán và điều trị kịp thời. Tại Mỹ, bệnh đa polyp tuyến đại trực tràng có tần suất 1/6000-1/30.000. Ở Việt Nam chưa có con số thống kê cụ thể về tần suất mắc bệnh. FAP gây nên bởi đột biến gen APC, đây là một gen có vai trò ức chế sự hình thành của khối u tân sinh ở đại tràng. Gen APC nằm ở vị trí 5q21-q22, gồm 15 exon mã hóa 9 kilobase RNA để tổng hợp nên phân tử protein với trọng lượng phân tử là 312 kD. Bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường nên người con chỉ cần nhận một allele bệnh từ bố hoặc từ mẹ sẽ biểu hiện bệnh [1]. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu phát hiện đột biến gen APC trên các gia đình đa FAP, cho đến nay khoảng 800 đột biến gen APC đã được phát hiện, tuy nhiên chỉ có đột biến tại một số vùng trọng điểm mới gây ra sự mất chức năng của gen. Exon 15 có thể được coi như là vùng đột biến trọng điểm (hotspot) của gen APC, khoảng 60-80% bệnh nhân FAP được phát hiện có đột biến ở exon này [2]. Ở Việt nam chưa có nghiên cứu nào ở mức độ gen trên bệnh nhân FAP được công bố. Đề tài này được tiến hành nhằm mục tiêu:
1.    Phát hiện đột biến gen APC trên một số gia đình bị bệnh đa polyp tuyến đại trực tràng.
2.    Bước đầu đưa ra tỷ lệ bệnh nhân và người lành mang gen để phát hiện sớm nguy cơ gây bệnh FAP.
2.    Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1.    Đối tượng
–     Nhóm nghiên cứu: 9 gia đình có thành viên bị FAP đã được chẩn đoán xác định tại Bệnh viện K trung ương dựa vào biểu hiện lâm sàng và kết quả giải phẫu bệnh.
–    Nhóm đối chứng: 6 người khỏe mạnh, không mắc bất kỳ một bệnh lý nào.
2.2.    Phương pháp nghiên cứu
2.2.1.    Tách chiết DNA từ máu toàn phần
–    Máu tươi chống đông bằng EDTA được tách chiết theo phương pháp phenol/chloroform.
DNA sau tách chiết sẽ được đo mật độ quang ở bước sóng 260/280nm để xác định nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch, chỉ có mẫu DNA nào đạt độ tinh sạch 1,8 – 2 mới được sử dụng cho quy trình tiếp theo.
2.2.2.    Phản ứng PCR
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuyếch đại exon 15 của gen APC, cặp mồi 15-1A có trình tự như sau:
Mồi xuôi:    5 – AGA GTG GCA CCC AAC CAT AG – 3′
Mồi ngược : 5′ – TCC CAT AAT GCT TCC TGG TC – 3′
Thành phần của phản ứng PCR: Phản ứng PCR có thể tích 30ụl gồm các thành phần: 100 ng DNA, 10 pmol mỗi primer, 200 ụmol/L dNTPs, 2 đơn vị enzym Taq polymerase và 2^L GeneAmp 10xBuffer
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 940C 5phút, 35 chu kỳ (940C – 30 giây, 550C – 45 giây, 720C – 45 giây) và 720C 5 phút..
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1 %, vạch đặc hiệu sau điện di được cắt và tinh sạch bằng Kit QIAGEN.