Phát hiện người lành mang Gen bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne bằng PCR định lượng

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy – DMD) là bệnh  lý cơ do di truyền thường  gặp  nhất,  được  phát  hiện  ở  tất  cả các chủng tộc khác nhau trên thế giới. Tần suất bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai. Đây là một bệnh lý cơ tiến triển nặng dần theo thời gian. Hầu hết trẻ trai mắc bệnh có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng suy yếu cơ biểu hiện bằng khi đi lại, khi đứng lên  ngồi  xuống  và  khó  khăn  khi leo cầu thang. Trong giai đoạn  nặng,  bệnh  nhân  trở nên tàn phế, mất khả năng đi lại vào lứa tuổi 12 và thường tử vong ngoài 20 tuổi do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp [1, 4, 9].

DMD là bệnh di truyền lặn liên kết giới tính, gây  nên  bởi  đột  biến  gen dystrophin. Gen này nằm ở vị trí Xp21 trên nhiễm sắc thể X, có chiều dài 2400 kb, gồm 79 exon, mã hoá 14kb mRNA và tổng hợp sản phẩm protein tương ứng là dystrophin. Protein dystrophin có mặt ở màng bào

tương của tế bào cơ và có chức năng bảo vệ tế bào cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ [6, 9]. Hiện nay, bản đồ đột biến gen dystrophin gần như đã  được  xác  định, trong đó  dạng  đột  biến  mất đoạn gen là phổ biến nhất, chiếm 60%. Dạng đột biến điểm đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 20 – 30%. Dạng đột biến lặp đoạn chiếm khoảng 10 – 15% [1, 9]. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy khoảng 1/3 trẻ trai bị bệnh là do đột biến mới phát sinh và 2/3 là do nhận gen bị đột biến từ người mẹ [2, 5, 9].

Hiện tại chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu bệnh DMD, chủ yếu chỉ điều trị triệu chứng, vật lý trị liệu nhằm làm chậm sự tiến triển của bệnh. Tuy nhiên, cuối cùng bệnh nhân vẫn tử vong, để lại  hậu quả nặng nề cho gia đình và xã hội. Bởi vậy, việc  chẩn đoán người lành mang gen bệnh, chẩn đoán trước sinh đang được ưu tiên chọn lựa, nhờ đó có thể đưa ra những lời khuyên di truyền giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh [4, 6]. PCR định lượng là phương pháp mới, giúp phát hiện các đột biến mất đoạn hay lặp đoạn gen, đã và đang được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu về các bệnh lý di truyền.  Nhiều  công  trình được  công  bố  gần  đây cho thấy  PCR định lượng  là  phương pháp  có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, đạt 100% [3, 4, 5, 10]. Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu cụ thể nào áp  dụng kỹ thuật  này  để xác  định bệnh nhân bị đột  biến  mất  đoạn  hay lặp  đoạn  gen, cũng  như ứng dụng để phát hiện người lành mang gen gây bệnh  dystrophin. Từ  thực  tiễn  đó,  chúng  tôi tiến hành đề tài với mục tiêu: trong gia đình bệnh nhân. Máu được chống đông bằng  EDTA với  nồng độ  1,5 mg/ml. Quy trình tách chiết DNA đó được chuẩn hóa theo Qiagen Kit. Nồng độ và độ tinh sạch ADN được xác định trên  máy  Thermo Electron Corporation của  hãng Biomate căn cứ vào tỷ lệ về giá trị mật độ quang đo ở  bước  sóng  260/280 và  chỉ có  mẫu  nào  đạt 1,7 – 2 mới  được sử  dụng  để  làm  các  phản  ứng tiếp theo.

Kỹ thuật PCR định lượng xác định người lành mang gen bệnh

Phát hiện người lành mang gen bệnh (me,chị Sử dụng 4 cặp mồi cùng nồng độ để khuyếch và em gái) trong gia đình bệnh nhân đã xác định có đột biến mất đoạn gen dystrophin.

I. ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG   PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng nghiên cứu

– Nhóm  chứng:  gồm  10 nam và  10 nữ  bình thường,  không  có  tiền  sử  gia đình mắc  bệnh  di truyền (bệnh DMD). Nhóm chứng được dùng như chứng  âm  người  bình thường  để  chạy  PCR cùng với mẫu bệnh nhân và những người trong gia đình của bệnh nhân.

– Nhóm nghiên cứu:

Ba bệnh nhân nam đó được chẩn đoán DMD, phân  tích DNA các  bệnh  nhân  này đã xác  định có  đột  biến  mất  đoạn  gen dystrophin và  được dùng như đối chứng dương để chẩn đoán người mang gen bệnh.9 thành viên nữ của ba gia đình này gồm mẹ, chị em gái, các dì và chị em họ của bệnh nhân.

2. Phương pháp nghiên cứu

2.1. Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số

Các mẫu ADN được tách chiết từ máu ngoại vi của nhóm chứng, bệnh nhân và các thành viên nữ

đại bốn exon của gen dystrophin ở bệnh nhân và các thành viên trong gia đình. Bốn exon được lựa chọn bao gồm 2 exon mà bệnh nhân bị đột biến và 2 exon không đột biến nhằm làm đối chứng âm. Mỗi phản ứng multiplex PCR có thể tích là 20 µL chứa các thành phần: 100 ng ADN, 40 ng mỗi primer, 200 µmol/L dNTPs, 2 đơn vị enzym Taq polymerase (do hãng  Qiagen cung cấp),  và 2 µL GeneAmp 10 x Buffer ( gồm 10 mmol/L Tris – HCl, pH 8,2 và 50 mmol/L KCl). Chu trình nhiệt của phản ứng như sau: Đầu tiên là giai đoạn biến tính ở 940C trong 5 phút, tiếp theo là 20 chu kỳ gồm biến  tính ở  940C trong 30 giây,  gắn  mồi  ở  600C trong 30 giây và bước kéo dài 720C trong 30 giây, cuối cùng là giai đoạn hoàn chỉnh ở 720C trong 5 phút và bảo quản tạm thời sản phẩm PCR ở 150C.

Sau khi khuyếch đại các exon của gen dystrophin, sản phẩm PCR được phân tích bằng 2 phương pháp: điện di trên thạch agarose nồng độ 2% và  điện  di mao quản  bởi  máy  Agilent 2100

Bioanalyzer.  Đậm  độ  các  băng  phân  tích  bởi thạch agarose được nhuộm với  ethidium bromide và sẽ được so sánh với nồng độ các exon đo được trên máy Agilent. Đối với mỗi gia đính bệnh nhân thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Đột biến mất đoạn và lặp đoạn gen dystrophin chiếm khoảng 70 – 75% các bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD). 2/3 trẻ bị bệnh DMD là do nhận gen đột biến nằm trên nhiễm sắc thể X của người mẹ dị hợp tử. Mục tiêu: sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện người lành mang gen bệnh. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 3 bệnh nhân DMD và 9 thành viên trong gia đình họ; Sử dụng các kỹ thuật: tách chiết  DNA, PCR định lượng.  Kết  quả:  trong 9 thành  viên nữ  của  ba gia đình bệnh  nhân  DMD mang gen dystrophin có đột biến mất đoạn có 4 thành viên ở dạng dị hợp tử. Kết luận: phát hiện thành công bệnh nhân DMD bị đột biến mới (không phải do di truyền từ mẹ) và phát hiện người lành mang gen bệnh (dị hợp tử) trong gia đình bệnh nhân. Phương pháp chẩn đoán mới này góp phần chẩn đoán trước sinh, làm giảm tỷ lệ mắc bệnh DMD.