Phát hiện người mang gen bệnh thoái hóa cơ tủy bằng kỹ thuật Multiplex Ligation – Dependent Probe Amplification

Thoái hóa cơ tủy (SMA) là bệnh di truyền có tiên lượng nặng. Bệnh nhân type 1 và type 2 thường chết sớm trong thời kỳ sơ sinh hoặc ở lứa tuổi học ñường do các biến chứng viêm phổi và suy hô hấp ; bệnh nhân type 3 thường mất khả năng ñi lại, tàn phế và chết ở tuổi trưởng thành [1,3]. SMA là bệnh di truyền lặn ñồng hợp tử trên nhiễm sắc thể số 5, có thể gặp ở nam giới và nữ giới. Người bố hoặc người mẹ mang gen bệnh tuy không biểu hiện bệnh nhưng sẽ truyền gen bệnh cho con. Trong trường hợp người bố và người mẹ ñều mang gen bệnh thì khả năng người con bị bệnh là 25%, người con bình thường là 25% và 50% người con mang gen bệnh. Trong trường hợp người bố hoặc người mẹ là người lành, kết hôn với người mang gen bệnh thì tỉ lệ người con mang gen bệnh là 50% [1, 3].Hiện nay, chưa có phương pháp ñiều trị ñặc hiệu bệnh SMA. Do vậy, việc phát hiện người lành mang gen bệnh (bố, mẹ, anh, chị, em) của bệnh nhân, tiến hành chẩn ñoán trước sinh trên những thai phụ có nguy cơ cao và giúp tư vấn di truyền vẫn là biện pháp cơ bản, ñược các nhà khoa học ñặt lên hàng ñầu nhằm hạn chế tỷ lệ sinh con bị bệnh. Kỹ thuật MLPA ñã ñược sử dụng nhiều trong chẩn ñoán các bệnh lý phân tử, ñặc biệt ñể phát hiện người lành mang gen bệnh vì quy trình dễ thực hiện, kết quả có ñộ tin cậy và chính xác cao [5, 6, 7, 8]. Nghiên cứu này ñược tiến hành nhằm mục tiêu: Phát hiện người lành mang gen trong các thành viên gia ñình của bệnh nhân SMA bằng kỹ thuật MLPA.
II.    ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Đối tượng
–    25 bệnh nhân SMA ñã ñược xác ñịnh có ñột biến xóa ñoạn exon 7, exon 8 của gen SMN1.
–    104 thành viên gia ñình của 25 bệnh nhân trên
(bao gồm: bố, mẹ, anh, chị và em của bệnh nhân)
–    20 người bình thường bao gồm 10 nam và 10 nữ dùng làm mẫu ñối chứng.
2.    Phương pháp
    Quy trình lay mau: 2ml máu tĩnh  mạch chống ñông EDTA 1,5 mg/ml, ñảm  bảo  vô trùng tuyệt ñối.
    Quy trình tách chiet DNA tong so:  theo quy trình phenol/chloroform [3]. Nồng ñộ và ñộ tinh sạch DNA tách chiết ñược kiểm  tra  trên phương pháp quang phổ NanoDrop 1000 (OD 260/280).
    Quy trình ky thu¾t MLPA xác ñ…nh  ñ®t bien xóa ñoan
–    Nguyên lý: Sử dụng 14 ñoạn dò DNA (probe)
lai ñặc hiệu với exon 7, exon 8 của gen SMN1. Mỗi probe  gồm  hai  chuỗi  oligonucleotid,  một  chuỗi ngắn và một chuỗi dài. Trong mỗi phản ứng chứa các probe nội chuẩn, khi probe nội chuẩn lên ñỉnh tương ứng là ñiều kiện ñảm bảo ñộ tin cậy của kết quả. Đồng thời sử dụng DNA của người bình thường làm ñối chứng chạy song song cùng mẫu bệnh nhân ñể so sánh. Sau phản ứng PCR, mỗi probe ñược khuếch ñại thành nhiều bản sao. Các probe khác nhau sẽ có kích thước khác nhau do ñộ dài ñoạn ñệm của chúng khác nhau. Do vậy, chúng sẽ ñược phân tách bằng phương pháp ñiện di (thường sử dụng phương pháp ñiện di mao quản). Số lượng sản phẩm khuếch ñại của mỗi probe tỷ lệ thuận với số bản copy của ñoạn DNA ñích ñặc hiệu với probe ñó.
Probe ñược thiết kế bởi hãng MRC – Holland (USA), kit  SALSA®  MLPA  –  P060. Trình tự  các đoạn ñặc hiệu của mỗi probe tương ứng với mỗi exon ñược ñính kèm theo kit..
–    Tiến hành: + Cho 5 µl DNA cần phân tích vào 1 ống PCR, biến tính ở 98oC/5 phút. Chuyển nhiệt ñộ về 2oC trước khi cho 3 µl hỗn hợp  chứa các ñoạn oligonucleotid của các probe. Hỗn hợp ñược ủ  ở  60oC/16 giờ  ñể  2  ñoạn  lai  của  2  phân tử oligonucleotid sẽ gắn với exon ñích ñặc hiệu ở vị
trí sát nhau. Thêm 32 µl hỗn hợp ligase buffer, ủ ở 54oC/15 phút, enzym ligase nối 2 ñoạn oligonucleotid của probe với nhau và phản ứng nối sẽ chấm dứt khi tăng nhiệt ñộ lên 98oC/5 phút. Hỗn hợp ñược giữ ở 4oC.
+ Khuếch ñại sản phẩm lai: Thêm 10 µl sản phẩm lai vào 30 µl hỗn hợp PCR buffer, giữ ở 60oC trước khi thêm 10 µl hỗn hợp PCR master. Thực hiện chu trình nhiệt  như  sau:  [95oC/30 giây,  60oC/30 giây,72oC/1 phút] x 35 chu kỳ, 72oC/20 phút.
Sản phẩm ñược bảo quản ở 4oC và ñược ñiện di mao quản huỳnh quang trên máy giải trình tự ñể phân tích kết quả. Chiều cao ñỉnh của exon 7 và exon 8 tỉ lệ thuận với số lượng bản copy của gen SMN1ñược khuyếch ñại. Như vậy, chiều cao ñỉnh của 12 gen nội chuẩn trong các mẫu gen là tương ñương nhau và chiều cao của exon 7, exon 8 của gen SMN1 ở mẫu chứng nam và nữ là tương ñương nhau. Người lành mang gen bệnh (xóa ñoạn exon 7 và exon 8 gen SMN1) có kết quả chiều cao các ñỉnh tương ứng của sản phẩm ñiện di bằng 1/2 chiều cao các ñỉnh tương ứng của nhóm chứng.
MLPA là kỹ thuật ñược sử dụng ñể phát hiện người lành mang gen bệnh của một số bệnh lý di truyền trong ñó có bệnh thoái hóa cơ tủy (Spinal Muscular Atrophy – SMA). MLPA cho phép chẩn ñoán tổn thương gen một cách chính xác và nhanh chóng. Mục tiêu: Phát hiện người lành mang gen bệnh trong các thành viên của 25 gia ñình bệnh nhân SMA bằng kỹ thuật MLPA. Đối tượng và phương pháp: Bệnh nhân ñược chẩn ñoán SMA nhờ triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng ñiển hình; DNA tổng số ñược tách chiết từ máu ngoại vi; sử dụng kỹ thuật MLPA phát hiện người lành mang gen bệnh. Kết quả: 100% bố mẹ của 25 gia ñình bệnh nhân SMA là người mang gen bệnh. 24/54 người anh, chị và em trong 25 gia ñình bệnh nhân SMA ñược phát hiện là người lành mang gen bệnh (44,4%), 30/54 thành viên của 25 gia ñình bệnh nhân không mang gen bệnh (55,6%).