PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN HEMOPHILIA

(Bằng kỹ thuật PCR – RFLP)

DETECTION OF HEMOPHILIA CARRIER BY PCR – RFLP

 

NGUYÊN LÝ

Tính đa hình (polymorphism) của một số đoạn gen là hiện tượng khác nhau một hoặc một nhóm nucleotid ở một vị trí nhất định trên gen nhưng không làm thay đổi hoạt động của gen. Các đa hình này thường nằm trong trình tự nhận biết của một hoặc một số enzym giới hạn và có thể được phát hiện khi sử dụng kỹ thuật PCR – RFLP. Xác định đa hình đặc trưng ở người bệnh hemophilia, sau đó sử dụng đa hình này để tìm kiếm cá thể mang gen trong gia đình dựa trên nguyên tắc các gen nằm gần nhau thì di truyền cùng nhau. Đầu tiên, sử dụng kỹ thuật PCR để nhân bản đoạn gen quan tâm có chứa gen đa hình, sau đó cắt sản phẩm PCR này với một enzym giới hạn đặc hiệu với vị trí đa hình. Quan sát các sản phẩm cắt, sẽ nhận dạng được gen.

Yêu cầu để thực hiện kỹ thuật:

+ Phải biết người mẹ là người chắc chắn mang gen hemophilia (carrier) và cần phải xét nghiệm đặc tính đa hình của gen ở người mẹ, người mẹ phải là người dị hợp tử với đặc tính đa hình.

+ Phải xét nghiệm đặc tính đa hình của bố và của người bệnh hemophilia (là anh trai hoặc em trai của người cần phát hiện hoặc người bệnh là một người nam giới liên quan khác như bác ruột về phía mẹ).

CHỈ ĐỊNH

Xét nghiệm này được chỉ định cho tất cả những người phụ nữ trong gia đình có tiền sử mắc bệnh Hemophilia mà có nhu cầu xác định tình trạng mang gen.

CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo.

Phương tiện – Hóa chất

Phương tiện

Máy PCR;

Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp ảnh;

Buồng vô trùng (biology cabinet);

Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);

Máy vortex;

Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;

Đầu côn có màng lọc;

Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;

Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;

Tủ lạnh 4 – 8^oC, tủ âm sâu – 20⁰C;

Găng tay.

Hóa chất

Sử dụng kit tách ADN thương mại. Nếu tách thủ công thì sử dụng các sinh phẩm cần thiết để tách chiết ADN như proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.

Hóa chất chạy PCR gồm: Đệm, MgCl₂, dNTPs, enzym kéo dài chuỗi, nước khử ion vô trùng, các cặp mồi đặc hiệu.

Hóa chất điện di: thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN, thuốc nhuộm ethidium bromide.

Bệnh phẩm

ml máu ngoại vi (của mỗi thành viên) đựng trong ống chống đông EDTA.

Phiếu xét nghiệm

Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu xét nghiệm.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Lấy bệnh phẩm

ml máu ngoại vi (của mỗi thành viên) đựng trong ống chống đông EDTA.

Tiến hành kỹ thuật

Bước 1: Tách chiết ADN

Xem bài “ Tách chiết ADN từ máu ngoại vi”.

Bước 2: PCR

Thực hiện phản ứng PCR với sự tham gia của các thành phần sau:

PCR buffer 10X 5 µl

ADN 100 ng

Forward primer (10pM) 1 µl

Reverse primer (10pM) 1 µl

Taq – polymerase 0.5 U

H₂0 đủ thể tích 50 µl

Bước 3: Cắt với enzym giới hạn

Thực hiện phản ứng cắt bằng enzym giới hạn với các thành phần sau: Đệm phù hợp với enzym giới hạn 3 µl Sản phẩm PCR 20 – 25 µl

Enzym giới hạn 2 µl

H₂0 đủ thể tích 30 µl

Bước 4: Điện di kiểm tra sản phẩm cắt

Sử dụng 20 – 25 µl sản phẩm cắt cùng với 10 µl sản phẩm PCR và thang ADN chuẩn (marker) điện di trên gel agarose. Tùy thuộc kích thước đoạn gen cần quan sát mà chọn nồng độ gel agarose và thời gian chạy điện di thích hợp.

Sau đó kết quả được đọc và phân tích thông qua hình ảnh soi trên đèn U

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Sản phẩm PCR phải có băng đặc hiệu, đúng kích thước theo tính toán lý thuyết.

Nếu sản phẩm cắt có 2 băng ADN trở lên tức là có vị trí nhận biết của enzym giới hạn (không có đa hình)

Nếu sản phẩm cắt vẫn còn nguyên sản phẩm PCR tức là mất vị trí nhận biết của enzym giới hạn (có đa hình).

Phương pháp phát hiện các đa hình gen đặc trưng ở người bệnh hemophilia sau đó sử dụng các đa hình này để tìm kiếm cá thể mang gen trong gia đình là phương pháp đã được thực hiện từ lâu trên thế giới. Ưu điểm của phương pháp là kỹ thuật thực hiện đơn giản, không cần phải đầu tư nhiều trang thiết bị đắt tiền và chi phí để thực hiện xét nghiệm thấp.

Tuy nhiên phương pháp này yêu cầu phải lấy mẫu của nhiều thành viên trong gia đình đồng thời phải biết được các đa hình có tần suất cao ở Việt nam.

Cách xác định tình trạng mang gen của một người nữ trong gia đình cóngười bệnh hemophilia:

Lấy mẫu: bố mẹ của người nữ cần xác định, người bệnh là anh trai hoặc em trai hoặc một người nam giới liên quan khác như bác ruột về phía mẹ.

Cách phân tích:

+ Phân tích người bệnh để xác định được allen liên quan đến gen yếu tố VIII đột biến.

+ Phân tích bố, mẹ để xác định di truyền của các allen (allen bình thường và allen liên quan đến gen đột biến) cho các con. Trong đó người mẹ bắt buộc phải là thể dị hợp tử với đa hình phân tích. Phân tích mẫu của bố sẽ xác định được allen truyền cho con gái.

Kết hợp các kết quả phân tích trên sẽ xác định được người phụ nữ mang gen trong gia đình.

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

SAI SÓT	XỬ TRÍ
Lấy mẫu không đủ hoặc sai chất chống đông.	Thực hiện theo đúng hướng dẫn qui cách lấy mẫu.
Thao tác pipet không chính xác.	Sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định.
Tín hiệu phản ứng không rõ ràng.	Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất Thực hiện đúng, đủ các bước trong quy trình xét nghiệm.

 

 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 

D J Bowen. Haemophilia A and Haemophilia B: molecular insights. J Clin Pathol: Mol Pathol 2002; 55: 1 – 8

Keeney S et al. The molecular analysis of haemophilia A: a guideline from the UK Haemophilia Centre Doctors’ Organization Haemophilia Genetics Laboratory Network. Haemophilia 2005; 11: 387 – 97