Phát hiện song nhiễm và định týp virus viêm gan c (HCV) và G (HGV) trên bệnh nhân viêm gan do virus

Từ bệnh phẩm là các mẫu hụyết thanh của bệnh nhân viêm gan virus được chẩn đoán huyết thanh học là viêm gan cấp tính với anti-HCV dương tính tại Hà Nội, RNA tổng số được tách chiết và thực hiện phản ứng RT-PCR thu nhận vùng gen 5’UTR gồm 295 nucleotide của HCV (Hepatitis c virus). RNA của các mẫu HCV dương tính được làm khuôn để thực hiện RT-PCR sử dụng mồi đặc hiệu của HGV (Hepatitis G virus) thu nhận vùng gen 5’UTR gồm 260 nucleotide của HGV. Một số mẫu chì cho sản phẩm HCV, trong khi đó một số mẫu cho sản phẩm HCV và HGV. Như vậy, HCV và HGV song nhiễm trên cùng một mẫu máu của bệnh nhân. Sản phẩm Rt-PCR được dòng hoá, tách dòng và giải trình trình tự. Kết quả truy cập Ngân hàng gen, phân tích so sánh thành phần nucleotide và quan hệ phả hệ, cho thấy 3 chuỗi nucleotide của HCV (Việt Nam) có thành phần nucleotide tương đồng cao vơi các chủng HCV thuộc genotýp 1a trong nhóm các chủng 1a/1b đã được công bố trên thế giới. Như vậy, 3 mẫu HCV của Việt Nam được xác định thuộc genotýp 1a phổ biến vùng Đông và Nam châu Á. Tương tự, chuỗi nucleotide của HGV cua Việt Nam (chủng HGV(Han9)VN được xác định thuộc týp 2 trong số 5 týp của HGV tồn tại trên thế giới. Việc thực hiện RT-PCR đã góp phần phát hiện song/đa nhiễm viêm gan, định týp và xây dựng kit chẩn đoán đa năng (multiplex-PCR/RT-PCR) sàng lọc các virus viêm gan truyền qua máu.
Từ khoá: RT-PCR, virus viêm gan c (HCV), G (HGV), 5’UTR, genotýp, tương đồng, phả hệ, multiplex-PCR/RT-PCR.
MỞĐẢU
Nhiễm virus viêm gan c (HCV-Hepatitis c virus) là một trong những nguyên nhân quan trọng dẫn đến viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư tế bào gan nguyên phát trên thế giới. Tỷ lệ nhiễm HCV ở Việt Nam có xu hướng ngày càng tăng, do chưa chú ý hoặc chưa có điều kiện cải tiến hệ thống sàng lọc máu và số người tiêm chích ma túy dùng chung bơm kim tiêm ngày càng gia tăng (Trần Thanh Dương, 2004; Bùi Đại, 2002). Các virus viêm gan có xu hướng đa nhiễm cùng nhau và cùng với HIV (Human Immunodeticiency Virus) tạo nên mối quan hệ lây nhiễm phức tạp va khó chẩn đoán phát hiện trong sàng lọc máu. Năm 1996, một loại virus RNA được phát hiện từ huyết thanh của một bệnh nhân mắc bệnh gan ờ Mỹ và được đặt tên là viêm gan GB virus c (Hepatitis GB virus C), sau đó được mang tên viêm gan virus G (HGV, Hepatitis G virus) có xu hướng song nhiễm cùng HCV hoặc/và HIV (Sampieừọ và cs, 1996; Keresztes và cs, 2003).
Hiện nay, bên cạnh phương pháp huyết thanh học, nhiều kỹ thuật khác nhau đã được sử dụng để chẩn đoán virus viêm gan trong đó có HCV. Do HCV và HGV hệ gen HCV ià RNA, nên trước đó cần có phản ưng chuyển đổi RNA thành DNA gọi là sao chép ngược (RT), sau đó mới nhân vùng gen cần nghiên cứu. Phản ửng RT-PCR (reverse transcriptase polymerase Chain reaction) đã giúp phát hiện nhiều virus RNA trong đó có viêm gan c và HIV ở giai đoạn sớm, chính xác và đặc hiệu, cũng như xác định tính song/đa nhiễm của chúng (Cau dai và cst 1998). Đối với các virus RNA, một trong những chỉ thị phân tử được dùng nhiều nhất là 5’UTR (vùng không mã hoá đầu 5′ của hệ gen) trong định týp và nghiên cứu phả hệ (Scott và Gretch, 2007) trong đó có các mẫu HCV của Việt Nam (Lê Thanh Hà và cs, 2006; Lê Thanh Hòa và cs, 2007).
Trong bài báo này chúng tôi giới thiệu kết quả định týp HCV và HGV, và phát hiện song nhiễm HCV/HGV trên bệnh nhân ở Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử. Điều này nhắc nhở việc cần thiết sử dụng cùng lúc các kỹ thuật, trong đó có sử dụng kit chẩn đoán đa năng phân tử (multiplex-PCR/RT-PCR) để sàng lọc triệt để các loại virus nguy hiểm truyền qua máu.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Mâu bệnh phẩm
Đố là 3 mẫu huyết thanh anti-HCV dương tính của 3 bệnh nhân ở Khoa Vi sinh vật, Viện Vệ sinh phòng dịch Quân đội. Một số mẫu huyết thanh HCV+ và HIV+ thu nhận tại Bệnh viện Bạch Mai. _    (
Tách chiết RNA tổng số chứa hệ gen RNA của virus viêm gan
RNA tổng số chứa hệ gen của virus HCV trong huyết thanh bệnh phẩm được tách chiết bằng bộ kit QIAamp RNA Viral Mini Kit (QIAGEN), theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phản ứng RT-PCR, tách dòng và giải trình trình tự
Phản ứng RT-PCR một bước (one-step RT-PCR) cùa hãng QIAGEN được sử dụng để thu nhận vùng 5’UTR:    *
a)    HCV (Caudai và cs, 1998); cho sản phẩm có độ dài 295 bp:
–    Mồi xuôi CC1F (5 -CAGAAAGCGTCTAGCCATGG-3′), gồm 20 nucleotide ờ vị trí 69-88.
–    Mồi ngược CC2R (5’-GAGGTTTAGGATTCGTGCTC-3’), gồm 20 nucleotide ờ vị trí 363-344.
b)    HGV (Naito và cs, 1999), cho sản phẩm RT-PCR với cặp mồi ngoài là 262 bp:
–    Mồi xuôi (HG1F): 5’- GGTCGTAAATCCCGGTCACC – 3’. Bao gồm các nucleotide từ 139 – 158.
–    Mồi ngược (HG1R): 5’ – CCCACTGGTCCTTGTCAACT – 3′. Bao gồm các nucleotide từ 381 – 400.
Sản phẩm RT-PCR là.đoạn DNA của vùng 5’UTR thu nhận, được dòng hoá vảo vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen). DNA plasmid tái tổ hợp được chọn lọc và tách chiết theo qui trình của hãng QIAGEN. Trình tự nucleotide của DNA của plasmid được giải trình trên máy tự động ABI-3100 Avant Genetic Analyzer (Mỹ) có tại Viện Công nghệ Sinh học. Chuỗi nucleotide được xử lý, so sánh đối chiếu bặíig các chương trình SeqEd1.03, AssemblyLIGN 1.9, MacVector8.2 (Accelrys Inc.), GENEDOC 2.6 và MEGA3.1 (Kumar và cs, 2004).
Phân tích chuỗi gen và định týp HCV/HGV
Định týp được thực hiện bằng cách so sánh với chuỗi gen 5’UTR của các genotýp đại diện sau khi truy cập Ngân hàng Gen tại http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. để thu nhận được các chuỗi cần thiết sử dụng so sánh và phân tích mối quan hệ phả hệ bằng chương trình MEGA3.1.