Phát triển kỹ thuật pcr khuếch đại vùng gen d1/d2 trong chẩn đoán nhanh viêm loét giác mạc do nấm

Viêm loét giác mạc nhiễm trùng là bệnh lý hàng đầu gây mù lòa trong số các bệnh lý giác mạc. Căn nguyên gây viêm loét giác mạc rất đa dạng, có thể do vi khuẩn, nấm, virus hoặc có thể kết hợp của các căn nguyên này [8]. Thực tế, trong vài thập kỷ gần đây, tỷ lệ viêm loét giác mạc do nấm gia tăng một cách đáng quan ngại, chiếm tới 16-37% các trường hợp viêm loét giác mạc [7]. Chẩn đoán được sớm loại căn nguyên gây viêm loét giác mạc rất có ý nghĩa cho việc bắt đầu ngay quá trình điều trị tấn công đặc hiệu, giúp chữa khỏi hoặc giảm thiểu tối đa sự hình thành sẹo giác mạc [2]. Kỹ thuật PCR chẩn đoán căn nguyên nấm viêm loét giác mạc có tính ưu việt hơn nhiều so với phương pháp chẩn đoán kinh điển bằng nhuộm soi và nuôi cấy [4]. Trong nghiên cứu trước, chúng tôi đã áp dụng kỹ thuật semi-nested PCR khuếch đại đoạn gen ITS để phát hiện nấm trong bệnh phẩm chất nạo giác mạc [1]. Tuy vậy, khi áp dụng cho chẩn đoán thường qui các bệnh phẩm lâm sàng, kỹ thuật nested PCR có những nhược điểm đáng phải cân nhắc. Đó là thời gian chẩn đoán phải kéo dài do thực hiện hai phản ứng PCR và nguy cơ dễ bị nhiễm DNA khi thường xuyên phải thao tác với các sản phẩm PCR đã được khuếch đại [3, 9]. Với mong muốn áp dụng được kỹ thuật PCR đơn để chẩn đoán hiệu
1
quả các mẫu bệnh phẩm lâm sàng, vùng gen D1/D2 nằm ở gần đầu 5″ của gen mã hóa cho tiểu phần 28S của rRNA đã được lựa chọn làm gen đích. Chúng tôi tiến hành cứu với mục tiêu: Phát triển kỹ thuật PCR khuếch đại vùng gen D1/D2 phát hiện căn nguyên nấm gây viêm loét giác mạc.
II.    Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu:
–    10 chủng nấm thuộc các loài Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Fusarium sp.
–    Các chủng vi khuẩn có khả năng gây viêm loét giác mạc bao gồm Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, và tế bào bạch cầu người được sử dụng như chứng (-) để đánh giá độ đặc hiệu của cặp mồi dùng xác định nấm.
–    Bệnh phẩm chất nạo giác mạc của 20 bệnh nhân được chẩn đoán hoặc nghi viêm loét giác mạc do nấm, và 2 bệnh phẩm của bệnh nhân được chẩn đoán viêm loét giác mạc do vi khuẩn tại Bệnh viện Mắt Trung ương. Bệnh phẩm được lấy theo qui trình thường qui tại Bệnh viện Mắt Trung ương. 100 |il dung dịch NaCl 0,9% sau khi rửa tiêu bản đã soi tươi được chuyển vào ống eppendorff để tách chiết DNA cho PCR.
Phương pháp nghiên cứu
–     Kỹ thuật nhuộm soi, nuôi cấy phân lập nấm được thực hiện tại Labo Vi sinh, Viện Mắt Trung ương.
–     Qui trình tách chiết DNA và PCR được thực hiện tại Khoa Vi sinh, Đại học Gifu, Nhật Bản.
+ DNA được tách chiết bằng kít MORA (AMR, Gifu, Japan).
+ PCR sử dụng cặp mồi NL1 (5’ -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) và NL4 (5 ’ -GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’) và chu trình nhiệt có được thay đổi (95°C/5 phút; 40 chu kỳ gồm 95 C /30giây, 55 C /60 giây, và 72 C /60 giây, kết thúc bằng 72 C /6 phút) so với mô tả của Kurtzman và cộng sự để khuếch đại đoạn dài khoảng 600 bp (vùng gen biến đổi D1/D2) nằm sát đầu tận 5’ của gen mã hóa cho tiểu phần lớn rRNA (LSU rRNA) [6]. Tất cả các lần làm PCR với bệnh phẩm luôn luôn có chứng âm và chứng dương chạy cùng để loại trừ hiện tượng âm tính và dương tính giả.
+ Để đánh giá và so sánh độ nhạy của PCR khuếch đại vùng gen D1/D2 và PCR khuếch đại vùng gen ITS, DNA của chủng nấm Aspergillus fumigatus được pha loãng bậc 10 giảm dần từ 50 ng đến 50 fg làm khuôn mẫu.
+ Qui trình PCR khuếch đại ITS theo mô tả của Ferrer và cộng sự [4]