Phát triển và hoàn thiện qui trình tách chiết ADN để xác định trực tiếp Escherichia coli gây tiêu chảy từ phân bằng PCR

Việc  xác  định  nhanh  các căn  nguyên  vi khuẩn  nói chung  và  Escherichia coli  gây  tiêu chảy  (DEC)  nói riêng bằng một kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao sẽ có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán và lựa chọn chế độ điều trị thích hợp cho bệnh nhân.  Mục tiêu:phát triển, hoàn thiện quy trình tách chiết  ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân và tối ưu hoá nồngđộ ADN khuô n cho phản ứng PCR đa mồi xác định DEC.  Đối tượng, vật liệu nghiên cứu:7 chủng DEC chuẩn, 10 mẫu phân trên lâm sàng. Phương phá p nghiên cứu:quy trình tách chiết ADN trực tiếp từ phân và PCR được sử dụng trong nghiên cứu này.  Kết quả:quy trình tách chiết ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân đãđược phát triển và tối ưu. Đây là quy trìnhđơn giản, không cần các máy móc và trang thiết bị phức tạp, dễ  thực hiện, toàn bộ quy trình cần khoảng 90 –  100 phút. Lượng ADN khuôn tối thiểu cần cho một phản ứng đểcó kết quả PCR dương tính là 100 ng. Kế t luận:nghiên cứu này góp phần quan trọng vào việc xác định sớm các DEC trong phân và là cơ sở cho các ngh iên cứu sau này xác định các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy trực tiếp từ phân.

Có  nhiều  phương  pháp  xác  định  các Escherichia  coli gây  tiêu  chảy  (DEC).  Phương pháp định danh kinh điển sử dụng các tính chất sinh  vật  hóa  học  và  ngưng  kết  với  kháng  huyết
thanh  đặc  hiệu,  phương  pháp  thử  nghiệm  trên động  vật  thí  nghiệm,  phương  pháp  miễn  dịch, phương pháp sử dụng kỹ thuật nuôi cấy trên tế bào và phương pháp sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử như  lai  ADN,  PCR.  Trong  số  các  phương  pháp trên, PCR rất hay được dùng vì kỹ thuật này có độ nhạy  và độ  đặc  hiệu  rất  cao.  Tuy  nhiên, cho  tới nay, phần lớn các quitrình sử dụng PCR để xác định  các  DEC,  đều  thông  qua  bước  cấy  bệnh phẩm phân trên các môi trường đặc, rồi tiến hành chọn lựa các khuẩn lạc để tách chiết ADN của vi khuẩn cho phản ứng PCR. Như vậy, cần ít nhất 24 –  30  giờ  để  phát  hiện  được  sự  có  mặt  của  DEC
trong phân [5].
Trên  lâm  sàng,  việc  xác  định  nhanh  các  căn nguyên vi khuẩn nói chung và DEC nói riêng bằng một kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, sẽ có ý  nghĩa  rất  quan  trọng  trong  chẩn  đoán  và  lựa chọn  chế  độ  điều  trị  thích  hợp  cho  bệnh  nhân.
Chính  vì  vậy,  chúng  tôi  tiến  hành  đề  tài  “Phát triển và  hoàn  thiện  qui  trình  tách  chiết  ADN  để xác định trực tiếp  Escherichia  coli  gây tiêu chảy từ phân bằng PCR” nhằm hai mục tiêu:
1.  Phát  triển  và  hoàn  thiện  quy  trình  tách chiết ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân.
2. Tối ưu hoá nồng độ ADN khuôn cho phản ứng PCR đa mồi xác định DEC.