Phát triển và hoàn thiện quy trình tách chiết ADN để ứng dụng pcr xác định trực tiếp Escherichia Coli gây tiêu chảy

Có nhiều phương pháp xác định các Escherichia  coli  gây  tiêu  chảy  (DEC).  Phương pháp định danh kinh điển sử dụng các tính chất sinh vật hóa học và ngưng kết với kháng huyết thanh đặc  hiệu,  phương pháp  thử  nghiệm  trên động vật thí nghiệm, phương pháp miễn dịch, phương pháp sử dụng kỹ thuật nuôi cấy trên tế bào và phương pháp sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử như lai ADN, PCR. Trong số  các  phương pháp trên, PCR rất hay được dùng vì kỹ thuật này có độ nhạy  và độ  đặc  hiệu  rất  cao. Tuy nhiên,  cho tới nay, phần lớn các qui trình sử dụng PCR để xác định  các  DEC,  đều  thông  qua  bước  cấy  bệnh phẩm phân trên các môi trường đặc, rồi tiến hành chọn lựa các khuẩn lạc để tách chiết ADN của vi khuẩn cho phản ứng PCR. Như vậy, cần ít nhất 24 – 30 giờ  để  phát  hiện  được  sự  có  mặt  của  DEC trong phân [5].

Trên  lâm  sàng,  việc  xác  định nhanh các  căn nguyên vi khuẩn nói chung và DEC nói riêng bằng một kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, sẽ có ý  nghĩa rất  quan trọng  trong chẩn  đoán  và  lựa chọn chế độ điều trị thích hợp cho bệnh nhân. Chính vì vậy,  chúng  tôi  tiến  hành  đề  tài  “Phát triển  và  hoàn  thiện  qui trình tách  chiết  ADN để xác định trực tiếp Escherichia coli gây tiêu chảy từ phân bằng PCR” nhằm hai mục tiêu:

1. Phát  triển  và  hoàn  thiện  quy trình  tách chiết ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân.

2. Tối ưu hoá nồng độ ADN khuôn cho phản ứng PCR đa mồi xác định DEC.

I. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ  PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng nghiên cứu

Các chủng DEC mẫu do GS Andrej Weitraub, viện Karolinska Thụy Điển cung cấp.

2. Vật liệu nghiên cứu

Sinh phẩm, hoá chất cho nuôi cấy, phân lập vi khuẩn. PCR master mix (Epicentre, Canada) được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

3. Phương pháp nghiên cứu

– Kiểm tra chủng bằng phương pháp định danh kinh điển.

Kiểm tra chủng bằng kỹ thuật PCR với 8 cặp mồi đặc hiệu cho các DEC theo như quy trình mô tả của Trung và cộng sự [4], PCR được tiến hành trên máy GienAmp PCR System 9700 AB (Applied Biosystem, Mỹ).  Trong nghiên  cứu  này,  theo quy trình của nhà sản xuất sinh phẩm PCR master mix, chúng tôi đã sử dụng 3 ml ADN khuôn mẫu, thay cho 2 ml như trong nghiên cứu trước đây.

Việc  xác  định nhanh các căn nguyên  vi khuẩn  nói  chung và Escherichia coli gây  tiêu chảy  (DEC) nói riêng bằng một kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao sẽ có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán và lựa chọn chế độ điều trị thích hợp cho bệnh nhân. Mục tiêu: phát triển, hoàn thiện quy trình tách chiết ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân và tối ưu hoá nồng độ ADN khuôn cho phản ứng PCR đa mồi xác định DEC. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu: 7 chủng DEC chuẩn, 10 mẫu phân trên lâm sàng. Phương pháp nghiên cứu: quy trình tách chiết ADN trực tiếp từ phân và PCR được sử dụng trong nghiên cứu này. Kết quả: quy trình tách chiết ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân đã được phát triển và tối ưu. Đây là quy trình đơn giản, không cần các máy móc và trang thiết bị phức tạp, dễ thực hiện, toàn bộ quy trình cần khoảng 90 – 100 phút. Lượng ADN khuôn tối thiểu cần cho một phản ứng để có kết quả PCR dương tính là 100 ng. Kết luận: nghiên cứu này góp phần quan trọng vào việc xác định sớm các DEC trong phân và là cơ sở cho các nghiên cứu sau này xác định các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy trực tiếp từ phân.