Phát triển và ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi trong chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy từ phân

Tiêu chảy là một vấn đề sức khoẻ toàn cầu. Bệnh hay gặp ở trẻ em. ở các nước đang phát triển, có ít nhất 1 tỷ trường hợp tiêu chảy hàng năm và số tử vong là 5 đến 7 triệu. Trung bình một năm một trẻ mắc 3,3 lần tiêu chảy. Tại Việt Nam, một số nghiên cứu cho thấy, số lần bị tiêu chảy trong một năm đối với một trẻ từ 2,2 –   6. Tại các nước công nghiệp phát triển, tiêu chảy vẫn còn phổ biến ở trẻ em, người già và các khách du lịch đến các nước đang phát triển. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy. Trong đó, vi khuẩn đóng vai trò quan trọng.

Trong số các vi khuẩn gây tiêu chảy, E. coli hiện nay là căn nguyên nổi trội, thu hút được sự quan tâm của các bác sĩ lâm sàng, nhi khoa, vi sinh vì nó là căn nguyên của 1/3 số trường hợp tiêu chảy. Việc chẩn đoán gặp khó khăn vì các triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu. Có 5 loại E. coli gây tiêu  chảy, được phân loại theo các cơ chế gây bệnh khác nhau dựa trên các gien nằm trong tế bào vi khuẩn mã hoá cho các yếu tố độc lực: Enteropathogenic E. coli (EPEC), enterohemorrhagic E. coli (EHEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteroinvasive E. coli  (EIEC)  và  enteroaggregative  E.  coli (EAEC) [3, 4]. Hiện nay có bốn phương pháp đ−ợc dùng để chẩn đoán các E. coli này:

• Dựa vào các tính chất sinh vật hoá học.

• Định týp huyết thanh.

• Các  thử  nghiệm dựa  trên  những đặc điểm về độc lực.

Các phương pháp này hầu như không thể chẩn đoán được hoặc rất tốn kém.

• Các phương pháp sinh học phân tử:

+ Hiện nay chủ yếu là hai phương pháp: Mẫu dò ADN (ADN probe) và phản ứng chuỗi (Pylymerase  Chain  Reaction  –   PCR).  Tuy nhiên độ nhạy của ph−ơng pháp mẫu dò ADN thấp, thao tác phức tạp và đòi hỏi một số lượng lớn vi sinh vật trong bệnh phẩm.

+ PCR là kỹ thuật tổng hợp acid nucleic trong ống  nghiệm. Trong đó, một đoạn ADN được nhân lên đặc hiệu. Trong kỹ thuật này, hai đoạn oligonucleotid, được gọi là mồi, gắn đặc hiệu vào đoạn ADN đích và được khuếch đại theo một số chu kỳ đ−ợc lặp đi lặp lại. Chu kỳ này gồm việc làm tách hai sợi của đoạn ADN, gắn hai oligonucleotid vào hai sợi này theo nguyên tắc bổ sung và kéo dài đoạn oligonucleotid d−ới tác động của enzym ADN polymerase. Trong PCR, ADN đích được tăng lên theo hàm số mũ sau mỗi chu kỳ. Sản phẩm của PCR được phát hiện sau khi điện di trên agarose, nhuộm bằng ethidium bromide và đọc d−ới ánh sáng đèn cực tím.

PCR là phương pháp đang đ−ợc áp dụng rộng rãi vì cho kết quả nhanh, chính  xác, độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Hiện nay, trên thế giới, PCR đang được nghiên cứu và ứng dụng trong chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy. Bình th−ờng trong một phản ứng PCR, người ta dùng một cặp mồi để khuếch đại một đoạn gien đặc hiệu. Để chẩn đoán xem trong bệnh phẩm có 1 trong số 5 loại E. coli gây tiêu chảy cần ít nhất 6 PCR riêng rẽ. Như vậy rất tốn kém. Vấn đề đặt ra là làm sao xác định được vi khuẩn này mà chỉ cần duy nhất 1 phản ứng PCR ? Nếu vậy, chúng ta không những tiết kiệm được nguyên vật liệu và thời gian mà còn tránh được sự nhiễm trong kỹ thuật này. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm hai mục tiêu:

1. Phát triển kỹ thuật PCR đa mồi  trong chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy.

2. ứng dụng kỹ thuật này để chẩn đoán các

E. coli gây tiêu chảy từ phân trẻ em dưới năm tuổi bị tiêu chảy.

II. đối tượng và Phương pháp nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu. Đánh giá một nghiệm pháp chẩn đoán và nghiên cứu mô tả.

PCR chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy từ bệnh phẩm phân. Chúng tôi sử dụng thường qui chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy bằng PCR theo th−ờng qui của Khoa Vi sinh lâm sàng, Bệnh viện Huddinge, Viện Karolinska, Stockholm, Thuỵ Điển. Bệnh phẩm phân sau khi thu thập được cấy lên trên môi trường cho vi khuẩn đường ruột, để ở 370 C sau 18-24 giờ. Vi khuẩn trên đĩa môi trường được hoà vào dung  dịch  đệm  phosphat,  đun  cách  thuỷ  ở 1000C trong 20 phút để phá vỡ màng tế bào vi khuẩn. ADN của vi khuẩn được giải phóng. Ly tâm dịch này với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút. Nước nổi sau khi ly tâm dùng làm ADN khuôn cho phản ứng PCR. Các cặp mồi đ−ợc thiết kế đặc hiệu với một số đoạn gen của ETEC, EHEC, EPEC, EIEC, EAEC (INTERACTIVA, Đan Mạch).

Sản phẩm của PCR sau đó được điện di trên agarose 1,5% trong dung dịch đệm TAE để tách biệt các ADN đã được khuếch đại. Nhuộm gel sau khi điện di bằng Ethidium bromide và nhìn dưới đèn cực tím sẽ cho phép thấy được các băng ADN đặc hiệu. So sánh các băng này với các băng của ADN mẫu.